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1. Laboratorio de Microbiología Molecular. Universitat de Girona, Campus de Montilivi, 17071Girona. nuriapoblet@hotmail.com. 2. Bacterial Molecular Pathogenesis. Faculty of Medical and Veterinary Sciences. University of Bristol BS40 5DU Langford, Bristol U.K.; 3. Servicio de Análisis Clínicos. Hospital Universitario Josep Trueta Av. França s/n 17007 Girona; 4: Centro de Investigación Básica de España (CIBE), Merck, Sharp and Dohne, 28027 Madrid.
La detección de Mycobacterium spp. mediante cultivo continúa siendo la técnica de elección para el diagnóstico de infecciones de origen micobacteriano, mientras que la correcta identificación a nivel de especie está basada en el análisis fenotípico y características bioquímicas de los organismos tras su aislamiento. Sin embargo, estas aproximaciones pueden estar limitadas, pues consisten en procesos largos, tediosos y con un pobre poder de discriminación. Además, un porcentaje de estos cultivos pueden presentar microbiota acompañante, dificultando aún más un diagnóstico exacto. En este sentido, el desarrollo de técnicas moleculares ha salvado alguna de estas limitaciones y ha acelerado en gran medida el desarrollo diagnóstico. En este contexto, el objetivo de este trabajo fue el desarrollo de un nuevo sistema basado en la técnica PCR-DGGE que permitiese detectar y diferenciar micobacterias a partir de muestras clínicas y ambientales.
La completa especificidad del sistema fue evaluada mediante PCR convencional analizando 100 aislados micobacterianos de diferente procedencia los cuales resultaron todos positivos, así como 63 aislados de otras especies estrechamente relacionadas filogenéticamente con resultados negativos en todos ellos. Además, se consiguieron niveles de detección de hasta 100 micobacterias por reacción.
Más adelante este sistema se utilizó para separar y analizar mezclas compuestas de Mycobacterium spp., mediante electroforesis en gradiente desnaturalizante. Para ello, se mezclaron cantidades equivalentes de DNA genómico de 4 especies de Mycobacterium (M. tuberculosis, M. gordonae, M. avium y M. bovis) pudiendo ser separadas e identificadas posteriormente mediante DGGE. Esta técnica se aplicará a muestras clínicas (esputos con sospecha de tuberculosis) y ambientales (leche de vaca y aguas de distinta procedencia).