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Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid. Avda. Puerta de Hierro s/n. 28040. Madrid. jbezosga@vet.ucm.es
La tuberculosis origina cuantiosas pérdidas económicas en ganadería producidas por gastos generados en la erradicación y compensaciones a los propietarios por el sacrificio obligatorio, descenso en las producciones, descenso en el aprovechamiento de nutrientes y decaimiento progresivo, y limitaciones al comercio de los animales y sus productos. El principal agente etiológico de la tuberculosis en cabras es Mycobacterium caprae. Aunque no existen datos oficiales de prevalencia de la enfermedad en cabras en España se conoce la presencia de rebaños fuertemente infectados en varias regiones.
El objetivo de este estudio fue la detección del patrón de citoquinas mediante un cultivo in vitro de sangre completa con antígenos específicos. Las células previamente sensibilizadas (procedentes de animales infectados) sintetizan determinadas citoquinas. El patrón de citoquinas generado varía entre animales, principalmente debido al estadio de la infección.
La sangre de cabras de rebaños infectados fue estimulada con PPD aviar, PPD bovina y PBS (control negativo). Simultáneamente se hizo un control positivo utilizando sangre estimulada con mitógeno (Pokeweed mitogen). Tras la incubación de la sangre 18 horas a 37ºC se procedió a la extracción del ARN total a partir de sangre completa (Aquapure RNA Blood Kit, Bio-Rad Lab). El ARN extraído fue tratado con DNase I (Invitrogen) para eliminar posibles restos de ADN residual y conservado a -80ºC. Posteriormente se realizó latranscripción reversa (RT) del ARN (iScript cDNA Synthesis Kit, Bio-Rad Lab.) y el cDNA de citoquinas caprinas importantes en la tuberculosis como IFN-g, IL-12, IL-2, TNF-a; and IL-10 fue amplificado utilizando los correspondientes primers específicos. Al detectar un amplio número de citoquinas, la técnica sería más sensible que la técnica de detección de IFN-g mediante el kit Bovigam (CSL). Una vez conocido el patrón de citoquinas en cada animal se compararon los resultados con los obtenidos mediante la técnica de ELISA para detección de IFN-g, intradermotuberculinización (IDTB) y cultivo bacteriológico.La detección de varias citoquinas Th1 permitió confirmar la infección en animales que habían dado resultados dudosos con la técnica de ELISA. Además, animales que no responden a la prueba de IFN-g, pero de cuyas muestras pudo aislarse posteriormente M. bovis o M. caprae, si fueron detectados con esta técnica. Como la producción de las citoquinas sigue una cinética diferente durante la infección pudo determinarse en que fase se encontraban los animales.
Con el objetivo de observar la correlación entre la transcripción del ARNm y la posterior producción de IFN-g y otras citoquinas se realizó la extracción del ARN a partir de sangre completa de un número determinado de animales a diferentes tiempos tras la estimulación (0, 2, 5 y 18 horas) y se observaron los diferentes patrones de producción en relación al tiempo transcurrido. Se observó que en los tiempos de incubación iniciales los niveles de ARNm y de citoquina secretada son bajos y que puede variar el momento en que comienza la producción de las diferentes citoquinas. Niveles elevados de ARNm se corresponderían con poca cantidad de citoquina secretada y a medida que aumentan los niveles de citoquina en plasma la cantidad de ARNm es menor.