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*Laboratorio de Citogenética y Genética Molecular. Facultad de Veterinaria. Miguel Servet, 177- 50013 ZARAGOZA. **Instituto Municipal de Salud Pública. Carretera de Cogullada s/n. 50014 ZARAGOZA. cgruas@unizar.es
Dada la importancia de la detección de Legionella de una forma rápida y poder cuantificar y discriminar las colonias vivas del total de colonias presentes en la muestra, se ha aplicado la metodología de RT-PCR para la consecución de estos objetivos.
La metodología RT-PCR permite detectar las colonias viables de Legionella, cuantificarlas y a la vez reducir el tiempo de análisis, en comparación con otros métodos más convencionales como la PCR o el crecimiento en cultivo.
En la puesta a punto se utilizaron kits comerciales para amplificar tanto el gen mip específico de L. pneumophila, como el gen 5S específico del género Legionella.
Tras la realización de diferentes ensayos no se obtuvo amplificación con ninguno de ambos kits, por lo que se desecharon y se amplificó un nuevo gen, el gen 16S, que detecta todos los miembros del género Legionella, pero en esta ocasión con diseño propio. Se diseñaron los cebadores y la sonda que amplifican una región de 79 pb perteneciente a dicho gen. De esta forma se consiguieron amplificaciones positivas para todas las muestras con presencia de Legionella, mientras que no hubo resultados de amplificación en ninguno de los controles negativos.