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(1) Departamento de Microbiología y Parasitología (2) Departamento de Biología Celular y Genética. Campus Universitario. Universidad de Alcalá. 28871 Alcalá de Henares. MADRID. e-mail: joser.lucas@uah.es
La secuenciación del genoma de Aspergilllus fumigatus permite abordar estudios de genómica funcional que conduzcan a la identificación de moléculas responsables del establecimiento de la aspergilosis invasora. La principal metodología empleada en estos análisis conlleva la deleción del gen candidato y la demostración de que la cepa delecionada es parcial o completamente avirulenta.
A pesar de la disponibilidad y versatilidad de varios marcadores auxotróficos en A. fumigatus, (por ejemplo pyrG, sC, niaD), los marcadores de transformación empleados para identificar posibles factores de virulencia en ensayos de infectividad son los genes bacterianos que confieren resistencia a higromicina y fleomicina. Estos genes bacterianos presentan importantes desventajas respecto a los marcadores auxotróficos, destacando la pérdida del marcador en ausencia de selección positiva, la restricción en el estabilizador osmótico usado en transformación o la existencia de un crecimiento residual de la cepa salvaje que dificulta la identificación de verdaderos transformantes.
En este trabajo analizamos la validez del sistema de transformación pyrG/pyr-4 para obtener knock outs en A. fumigatus sin afectar el proceso de virulencia. Se construyó el plasmido pPIRG4 que contiene el gen pyr-4 de N. crassa flanqueado por la región promotora y terminadora de su homólogo, el gen pyrG de A. fumigatus. Dicha construcción fue empleada para delecionar el alelo pyrG- de la cepa CEA22 mediante re-emplazamiento génico, confirmándose este evento mediante Southern blotting.
Utilizando un modelo murino de infectividad que mimetiza la producción de aspergilosis pulmonar invasora en humanos (Smith et al. 1994) se analizó la infectividad de 3 transformantes pyrG::pyr-4+ seleccionados comparándose ésta con la de 3 cepas de referencia de A. fumigatus: 293 (cepa empleada en la secuenciación del genoma), 237 y ATCC46645. Los resultados obtenidos de los ensayos de infectividad demuestran que los 3 transformantes seleccionados son tan virulentos como las 3 cepas de referencia testadas. Adicionalmente, la realización de cortes histológicos de pulmones infectados y su tinción con plata-metenamina-hematoxilina demuestra similares patrones de colonización del parénquima pulmonar en todas las cepas virulentas.