Separación de células cultivables y no cultivables mediante gradiente de densidad

Orruño, M. , Seco, C. , Calera, A., Arana, I., Muela, A. y Barcina, I.

Dpto. Inmunología, Microbiología e Inmunología. Fac. Ciencia y Tecnología. Universidad del País Vasco. Apdo. 644. 48080 Bilbao. (isabel.barcina@ehu.es)

El significado biológico del estado viable no cultivable (VNC) está en entredicho desde su descripción (Roszak & Colwell, 1987). La aceptación del estado VNC como parte integrante de un ciclo de vida requiere la comprobación inequívoca de que las células VNC revierten al crecimiento vegetativo. Esta exigencia plantea un problema metodológico complejo, dada la heterogeneidad de las poblaciones bacterianas compuestas por mezclas de células cultivables y no cultivables.

Siegele et al. (1993) propusieron un método de separación de células cultivables y no cultivables por centrifugación en gradiente de densidad de Renografin-76+ (otras denominaciones, Radioselectan o Urografin). Desnues et al. (2003) y Cuny et al. (2005) tambien han utilizado este método de separación para obtener poblaciones no cultivables.

En nuestro laboratorio hemos aplicado este método en Escherichia coli. En todos los casos estudiados, las diferentes bandas que se obtienen tras la centrifugación contienen poblaciones heterogéneas, si bien las células no cultivables se posicionan preferentemente en las bandas de mayor densidad.

La toxicidad de los medios de contraste iodados iónicos (p.e. Urografin) ha sido puesta de manifiesto para células eucariotas (Fanning et al., 2002). Hemos podido comprobar el efecto negativo del Urografin sobre la actividad de celular de E. coli. El tiempo de exposición, la temperatura y la concentración de Urografin determinan el grado de afectación celular.

Teniendo en cuenta estos resultados, consideramos que es necesario perfeccionar el método de separación de células no cultivables y proponemos su combinación con otras técnicas ya descritas a la hora de estudiar la reversión de las células VNC al crecimiento vegetativo.

Cuny, C., L. Dukan, L. Fraysse, M. Ballesteros, S. Dukan. 2005. J. Bacteriol. 187: 2244-2248.

Desnues, B., C. Cuny, G. Grégori, S. Dukan, H. Aguilaniu, T. Nyström. 2003. EMBO Reports 4: 400-404

Fanning, N.F., B.J. Manning, J. Buckley, H.P. Redmond 2002. British J.Radiol. 75: 861–873

Roszak, D.B., R.R. Colwell. 1987. Microbiol. Rev. 51: 365-379.

Siegele, D.A., M. Almirón, R. Kolter. 1993.In: Starvation in bacteria. S. Kjelleberg (ed.)pp. 151-170. Plenum Press, NY.