H - 176
Área de Microbiología, Departamento de Biología Funcional, Universidad de Oviedo, Facultad de Medicina, Julián Clavería s/n, 33006 Oviedo (Asturias). (auroraesminombre@hotmail.com)
La lactococosis, cuyo agente causal es Lactococcus garvieae, es una de las patologías emergentes en acuicultura continental. A pesar de que ocasiona importantes pérdidas económicas, se tienen pocos conocimientos sobre su agente etiológico, modos de transmisión y sistemas de prevención.
En el presente trabajo se desarrolló por primera vez un método de transformación en este microorganismo para, a continuación, abordar el análisis genético del mismo mediante mutagénesis por transposición.
La transformación de L. garvieae se realizó por electroporación utilizando el plásmido pGKV210 y uno de los protocolos descritos con anterioridad para L. lactis, modificado convenientemente para su adaptación a las características de dicha bacteria. Además, con el fin de optimizar la eficiencia de transformación se analizaron diversos parámetros eléctricos y fisiológicos: fase de crecimiento del cultivo celular a partir del cual se elaboraron las células competentes, la composición del medio de cultivo, la duración e intensidad del pulso y del campo eléctrico, etc.
El protocolo desarrollado se aplicó a distintas cepas de L. garvieae obteniendo resultados similares en todas ellas, con eficiencias de transformación que fluctuaron entre 103 y 105 transformantes/µg ADN.
Tras la puesta a punto de un sistema de electrotransformación que permitió obtener eficiencias adecuadas, se utilizó el plásmido pTV408 portador del transposón Tn917 para la construcción de genotecas de inserción por transposición que permitieron la identificación de genes implicados en diferentes funciones celulares. Los resultados obtenidos al analizar por Southern Blot y secuenciación las inserciones en diferentes transformantes parecían indicar que la transposición en el cromosoma tiene lugar al azar. Con el fin de corroborar estos resultados se llevó a cabo la selección de un mutante específico incapaz de fermentar el manitol.
El desarrollo de la electrotransformación y de la mutagénesis mediante transposición de L. garvieae sienta las bases para el estudio genético de dicho microorganismo. Los pasos a seguir en un futuro estarán dirigidos a poner apunto la mutagénesis de marcaje (signature-tagged mutagenesis) para la identificación y análisis de genes implicados en el proceso infeccioso.