Detección de anguilas portadoras del patógeno humano y de peces Vibrio vulnificus serovar E mediante su aislamiento e identificación por PCR

Valiente, E¹ y Amaro, C¹

¹Universidad de Valencia, Edificio de investigación, Departamento de Microbiologia y Ecologia, Burjasot, Valencia, España. carmen.amaro@uv.es

La bacteria patógena Vibrio vulnificus serovar E produce tanto casos esporádicos de infecciones humanas como epizootias de alta mortalidad en anguilas cultivadas. En este trabajo, desarrollamos y ensayamos a escala de laboratorio y de campo, un protocolo para la detección incruenta de anguilas portadoras sanas compatible con el aislamiento del patógeno. En la primera fase del trabajo realizamos una serie de experimentos a escala de laboratorio para averiguar los órganos en donde el patógeno persistía tras la infección. Para ello, infectamos a través del agua lotes de anguilas que mostraban distintos grados de inmunidad frente al patógeno y seguimos el proceso infeccioso microbiológica y microscópicamente durante 72 horas. Usamos dos protocolos distintos para el aislamiento de la bacteria, uno a partir de órganos internos, en donde el patógeno sobrevive sin competidores, y otro a partir de los externos, en donde se enfrenta a microbiota competidora (1). Las colonias aisladas las identificamos mediante una PCR específica de serovar E (2) y confirmamos la identificación por métodos clásicos (3). Los resultados que obtuvimos demostraban que el patógeno se acantonaba preferentemente en agallas y bazo. Así, la bacteria colonizaba y se multiplicaba en las agallas desde donde entraba en sangre y se extendía a los órganos hematopoyéticos y al hígado. Las anguilas vacunadas eran capaces de eliminar el patógeno de todos los órganos externos e internos en menos de 9 horas, confirmando la eficacia de la vacunación como medida preventiva para controlar la enfermedad y su transmisión al hombre. Seleccionamos las agallas como órgano a muestrear y ensayamos el protocolo en dos piscifactorías en ausencia de brotes infecciosos y con anguilas sanas. Demostramos la eficacia del protocolo al aislar cepas del patógeno de animales sin síntomas procedentes de una piscifactoría que había registrado el último caso de vibriosis en el año 2000. Las cepas aisladas han sido incluidas en nuestra colección para estudios posteriores.

1.SanJuan, E and C. Amaro. 2004. Protocol for specific isolation of virulent strains of Vibrio vulnificus serovar E (biotype 2) from environmental samples. Appl. Environ.Microbiol. 70: 7024-7032.2.

2.Lee, C-T, C. Amaro, E. Sanjuán and L-I, Hor. Identification of DNA sequences specific for Vibrio vulnificus biotype 2 strains by suppression subtractive hybridization. Appl. Environ. Microbiol. (in press).

3.Biosca, E.G., C. Amaro, J.L. Larsen, and K. Pedersen. 1997. Phenotypic and genotypic characterization of Vibriovulnificus: proposal for the substitution of the subspecific taxon biotype for serovar. Appl. Environ. Microbiol. 63: 1460- 1466.