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Laboratorio de Salud Pública del Principado de Asturias. Camino de Rubín s/n. 33011 Oviedo. Asturias. mjosela@princast.es.
La Directiva 98/83/CE relativa a la calidad de las aguas destinadas al consumo humano contempla, entre los parámetros que deben de realizarse, el recuento de Clostridium perfringens incluidas sus esporas. El objeto de este trabajo es la evaluación de un método de confirmación de esta especie que resulte sencillo y rápido en su ejecución.
La técnica de CAMP test para Clostridium perfringens es la misma que la utilizada para otros microorganismos como Listeria monocytogenes. En este caso se utiliza la bacteria Streptococcus agalactiae (Landfield grupo B) para inducir hemólisis sinérgica con el C. perfringens productor de a -toxina, cuando este se enfrenta al estreptococo en ángulo de 90 grados (a 1-2 mm de distancia) en placas de agar sangre de cordero. Un resultado positivo se identifica como una zona de hemólisis amplificada en forma de punta de flecha redonda después de 24 horas de incubación en anaerobiosis.
En total se estudiaron 124 cepas, 16 cepas de colección procedentes de Centro Español de Cultivos Tipo (CECT) del género Clostridium (nueve de ellas eran de la especie Clostridium perfringens y siete Clostridium de otras especies) y el resto aislamientos del género Clostridium en el medio TSC con cicloserina de las aguas analizadas en el Laboratorio.
Las cepas de colección fueron procesadas siguiendo las indicaciones de reconstitución del liofilizado del CECT. Las cepas salvajes se aislaron siguiendo el protocolo del borrador de la Norma ISO/CD 6481-2 de 2002. Se describieron las distintas morfologías de las colonias en TSC y una colonia de cada tipo se pasó a medio de Columbia Agar Sangre de cordero (Bio-Merieux) en aerobiosis y anaerobiosis para obtener cultivos puros y anaerobios estrictos.
Se comprobó la morfología de todas las cepas en estudio mediante la tinción de Gram y a todas aquellas colonias bacilos gram positivos se realizaron las pruebas de identificación indicadas en la Norma ISO 7937:2004 y el CAMP test. Se consideró C. perfringens todas aquella cepas que cumplían los requisitos de la Norma: motilidad negativa, reducción de nitratos, licuefacción de la gelatina y lactosa positivos y producción de gas y SH2 en medio de lactosa-sulfito.
La sensibilidad del CAMP test fue de un 100%, su especificidad de 95,12%, un 2,35% de falsos positivos y un 0% de falsos negativos.
A la vista de estos resultados el CAMP test reverso se considera como un método válido de confirmación del Clostridium perfringens aislados en aguas continentales, es fácil de realizar y económico, ya que con solo una placa de agar sangre se pueden realizar al menos cinco test. Después de 24 horas de incubación el test se puede evaluar sin necesidad de más preparación y materiales.