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(1)Instituto de Biotecnología, INBIOTEC, León. (2)Area de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de León, León. E-mail: degnaf@unileon.es
Streptomyces natalensis es el productor industrial del antifúngico pimaricina. Este antibiótico pertenece a la familia de los macrólidos polienos y es muy utilizado en la industria alimentaria, especialmente en la conservación de quesos y otros alimentos no estériles como carnes curadas, fiambres etc. Asimismo, se está utilizando con éxito en oftalmología, para prevenir infecciones fúngicas en los transplantes de córnea, y en el tratamiento de queratitis del mismo origen.
La agrupación génica responsable de la biosíntesis de pimaricina se extiende a lo largo de unas 90 kb de ADN del cromosoma de S. natalensis, donde se han encontrado 18 posibles marcos de lectura abiertos. Entre éstos, 5 genes codifican 5 enzimas multifuncionales componiendo la policétido sintasa de la pimaricina. Los 13 genes restantes codifican 13 proteínas adicionales que llevan a acabo las modificaciones post-PKS del esqueleto policétido, la exportación y la regulación de la expresión génica.
La secuenciación del extremo izquierdo de la agrupación génica responsable de la biosíntesis depimaricina permitió la identificación de un gen de 915 nucleótidos, pimM, situado corriente arriba del gen pimR, el regulador positivo de la biosíntesis de pimaricina. En base a homología de secuencia, se trata de un regulador de tipo LuxR, semejante a los reguladores de respuesta de sistemas de dos componentes.
Con el fin de conocer la función del gen pimM se realizó el reemplazamiento génico del mismo por un gen mutado no funcional. Para ello se realizó una deleción del fragmento de ADN de pimM correspondiente a la zona que codifica para el sitio HTH de unión a ADN (388 pb), originando un salto de marco en la lectura. Se utilizó el fago KC515 (c+, attP-) para llevar a cabo el reemplazamiento génico, obteniéndose por doble recombinación la cepa mutante S. natalensis D9 con el gen pimM alterado. Se analizó el efecto de esta mutación sobre la producción de pimaricina, tanto mediante bioensayo frente a Candida utilis como por HPLC, observándose en ambos casos una ausencia total de pimaricina, indicando que PimM es un regulador positivo de la biosíntesis del antifúngico. El análisis de la expresión de los genes de la agrupación génica de la biosíntesis de pimaricina por RT-PCR reveló que en S. natalensis D9 no hay transcripción de varios genes implicados en la biosíntesis, demostrando así que este regulador activa la transcripción de algunos de los genes de la agrupación génica.