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Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Barcelona. Av. Diagonal 645, Barcelona 08028. e-mail: irrisbcn@yahoo.com
La celulasa Cel9B de Paenibacillus barcinonensis ha sido clonada y caracterizada previamente por el grupo investigadora partir del clon recombinante Escherichia coli/pC7, procedente de una genoteca del organismo arriba mencionado [1]. Cel9B partenece a la familia 9 de glicósido hidrolasas (EC 3.2.1.4). Como la mayoría de enzimas de esta familia, la celulasa clonada presenta una estructura modular con varios dominios funcionales: un dominio catalítico (GHF9), dos dominios de unión a celulosa (CBD3) y dos dominiosafines a fibronectina (Fn3). La enzima hidroliza enlaces 1,4-b-glicosidicos internos de la molécula de celulosa generando oligosacáridosde longitudes variables, y presenta una actividad típica de las endoglucanasas: hidrólisis muy eficiente sobre celulosa amorfa (CMC y liquenano) y baja sobre celulosa cristalina (Avicel).
Cel9B ha sido evaluada en ensayos papeleros para modificar y mejorar las propriedades mecánicas del papel. El tratamiento con la celulasa Cel9B mejora la resistencia mecánicas del papel, ejerciendo un efecto de biorefinado equivalente a un incremento de 1,000 revoluciones en el refinado mecánico de la pasta de papel, lo que puede suponer un importante ahorro energético [2]. El tratamiento con la enzima revierte el fenómeno de perdida de propiedades por secado, conocido como hornificación. El efecto beneficioso de la aplicación de la celulasa es una característica diferencial de Cel9B, que no tiene paralelo en otras celulasas de laboratorio o comerciales ensayadas hasta el momento.
Para identificar las características moleculares de la enzima, que correlacionan con su efecto de biorefinado, se procedió a la clonación de los distintos dominios que la componen, de forma independiente. En primer lugar se procedió a la clonación del dominio catalítico. Para ello se diseñaron dos construcciones genéticas que se clonaron en varias cepas de E.coli. La primera construcción delimita el dominio catalítico entre los aminoácidos 40 y 481, y la segunda delimita dicho dominio entre los aminoácidos 40 y 504.
Al comparar el nivel de actividad hidrolítica de las dos celulasas truncadas entre sí, así como con el de la celulasa original, la segunda celulasa truncada resultó más activa que la primera pero ambas fueron considerablemente menos activas que la enzima original.
Los clones obtenidos en las distintas cepas de E.coli son inestables, posiblemente debido a la toxicidad de la proteína truncada al ser sobreexpresada en dichas cepas. Para evitar los problemas de inestabilidad, está en proceso la clonación de las proteínas truncadas, bajo control de promotores inducibles, en huéspedes del genero Bacillus, tal como Bacillus subtilis MW15, cepa deficiente en celulasas y proteasas.
[1]Pastor, F.I.J., Pujol, X., Blanco, A., Vidal, T., Torres, A.L., Díaz, P. (2001). Appl. Microbiol. Biotechnol. 55: 61-68
[2]García, O., Vidal, T., Torres, A.L., Colom, J.F., Pastor, F.I.J., Sánchez, M., Díaz, P. (2003). Ingeniería Química 401: 84-90.