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1Centro de Investigaciones Biológicas, C.S.I.C., Ramiro de Maeztu, 9 28040 Madrid (España). 2Institut für Angewandte Genetik und Zellbiologie, BOKU-University of Natural Resourcesand Applied Life Sciences, Muthgasse 18, A-1190 Vienna (Austria). lidiaarba@cib.csic.es
En los eucariotas el tráfico núcleo-citoplásmico de macromoléculas tiene lugar a través del complejo del poro nuclear. Este proceso está mediado por una familia de receptores denominados carioferinas entre las que se pueden distinguir importinas, que median el importe nuclear, y exportinas, encargadas del exporte. La ruta de exporte mediada por Crm1p/Exportina-1 es la mejor conocida y sus cargas presentan una señal de exporte nuclear (NES) rica en leucinas. La leptomicina B (LMB) inhibe la función de esta exportina, uniéndose a un residuo conservado de cisteína localizado en la región que une a la NES. En Sacharomyces cerevisiae el cambio de esta cisteína por una treonina hace a la levadura insensible a la droga.
Hemos identificado el ortólogo de Crm1p (S. cerevisiae) en A. nidulans, designado como KapK. Aspergillus, y probablemente otros hongos ascomicetos, es resistente a la LMB porque carece de la cisteína que es recocida por esta droga. Mediante mutagénesis dirigida se generó un alelo sensible a LMB, alelo kapK1, mediante la substitución Thr525Cys. Para comprobar el efecto de la substitución de este aminoácido en la ruta de exporte que media KapK, se generaron proteínas fluorescentes quiméricas que contenían únicamente señales de importe nuclear o conjuntamente con una NES. En el fondo genético kapK1, las proteínas de fusión que portaban la NES se acumulaban en el núcleo en presencia de LMB, demostrando que la función de KapK1 es impedida por LMB. Adicionalmente, hemos buscado un cargo natural de KapK, el activador específico de ruta NirA, que media la regulación de la expresión génica dependiente de nitrato. NirA es nuclear cuando el hongo crece con nitrato, mientras que su localización es exclusivamente citoplásmica en presencia de amonio. La salida del núcleo de NirA es dependiente de la ruta mediada por KapK. NirA es la primera proteína de un hongo filamentoso que se caracteriza como una carga de una exportina miembro de la familia Crm1p/Exportina-1.
Las cepas sensibles a LMB que se han generado pueden ser utilizadas para estudiar en detalle el exporte nuclear en A. nidulans; así como la regulación de la localización subcelular de factores de transcripción que son excluidos del núcleo. Por otra parte, el exporte nuclear ha sido estudiado exclusivamente en organismos uninucleares, por tanto, el hongo filamentoso coenocítico A. nidulans constituye un novedoso escenario donde estudiar este proceso en profundidad.