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1. Instituto de Biotecnologia de León (INBIOTEC). Av. Real s/n, Parque Cientifico de León. 2. Universidad de León, Campus de Vegazana s/n, 24005 León.
Diversos antibióticos b-lactámicos como penicilinas y cefalosporinas continúan siendo medicamentos de elección en el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas. Por tanto, el conocimiento completo de la ruta biosintética de penicilinas y cefalosporinas es de gran interés industrial por su importancia en la mejora de la producción y la diversificación de estos antibióticos.
Un intermediario importante de estas rutas metabólicas es la isopenicilina N. Se ha encontrado recientemente, que la isopenicilina N es convertida a penicilina N, a través de una reacción enzimática de epimerización en tres pasos, reacción que no había sido descrita antes en la biosíntesis de antibióticos. Con objeto de estudiar la biología molecular de dicho proceso es necesario disponer de isopenicilina N.
En este trabajo hemos desarrollado por primera vez, un método eficiente, rápido y no contaminante, para la obtención de isopenicilina N pura.
Previamente, se había descrito la obtención de isopenicilina N mediante síntesis química o purificación a partir de caldos de cultivo o micelio de los hongos productores: Penicillium chrysogenum y Acremonium chrysogenum. Sin embargo, los rendimientos obtenidos con los procedimientos de síntesis química son muy bajos además de ser muy largos, laboriosos y altamente contaminantes. Respecto a la purificación de isopenicicilina N a partir de los caldos de cultivo de los hongos, todos los protocolos presentes en la bibliografía emplean sustancias toxicas como la piridina, y además, son procesos de micropurificación.
En nuestro laboratorio se obtuvo una cepa de A. chrysogenum denominada TD189 en la que se han interrumpido los genes que intervienen en la epimerización de la isopenicilina N en penicilina N, consiguiendo de este modo que se acumule isopencilina N en los caldos de cultivo como único compuesto bioactivo. Usando esta cepa se desarrollo un método simple para la purificación de isopenicilina. En dicho método, inicialmente el caldo se filtra y trata con acetona para posteriormente pasarlo por un tándem de columnas cromatográficas, una de carbón activo y otra conteniendo una resina hidrofóbica SM2. Una vez recogido el eluyente, se liofiliza para concentrar y a continuación, se realiza una cromatografía de gel filtración a través de una resina sephadex G25. Finalmente, la muestra se purificó por HPLC empleando una columna semipreparativa de fase reversa C18. El resultado es la obtención de la isopenicilina N con una pureza mayor del 95% y un rendimiento del proceso total del 25%.