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Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”, Universidad Autónoma de Madrid, Cantoblanco, 28049 Madrid. mbsanchez@cbm.uam.es
La puromicina es un antibiótico aminonucleosídico producido por S. alboniger. El cluster de biosíntesis consta de 10 orfs que codifican los genes de biosíntesis y resistencia. El gen pur8, con homología con proteínas transportadoras dependientes de un gradiente de protones, proporciona resistencia a puromicina cuando se expresa en S. lividans 1326, y por ello se le ha asociado una función de resistencia al antibiótico en S. alboniger, además de una posible función transportadora de N-acetilpuromicina, último intermediario de la ruta de biosíntesis. El gen pur8 se transcribe en forma monocistrónica y en sentido contrario al resto de los genes del cluster, presentando su máximo de expresión antes del inicio de la biosíntesis del antibiótico, al inicio de la curva de crecimiento.
Se intentó la eliminación de la secuencia completa del gen pur8 en el organismo productor, S. alboniger, sin éxito. Únicamente se obtuvo la eliminación de los 7 primeros dominios transmembrana, lo cual no afecta a la producción de puromicina aunque sí a los niveles de resistencia, reduciéndolos (1). Sin embargo se realizó la eliminación de la secuencia total del gen pur8, mediante recombinación homóloga en Escherichia coli (2), en los cósmidos pPB5.13 y pCXS, conteniendo el cluster pur completo. Estos cósmidos se utilizaron para estudiar el efecto de su mutación en el organismo heterólogo S. lividans 1326. El resultado observado fue una reducción de los niveles de resistencia a puromicina, además de una disminución de los niveles de puromicina producida, sin acumulo intracelular de N-acetilpuromicina, último intermediario de la ruta. Todo esto junto con la baja actividad de la encima Pac, cuyo gen se expresa en un policistrón con el resto de los genes del cluster, parece indicar que la eliminación del gen pur8 afecta negativamente la expresión del resto de los genes del cluster, a pesar de poseer una expresión independiente.
(1) Martínez, J. I. (1998). “Transformación y deleción génica en S. alboniger: estudio sobre la función de los genes napH y pur8 del cluster pur”. Tesis doctoral. Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma de Madrid.
(2) Gust, B., Challis, G. L., Fowler, K., Kieser, T. and Chater, K. F. (2003). PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 1541-1546.