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Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Cantoblanco, UAM y CSIC, Madrid 28049. 1Dirección actual, Universidad Francisco de Vitoria. maria_r@cbm.uam.es
Las sordarinas actúan inhibiendo específicamente la síntesis de proteínas en hongos. El aislamiento de mutantes resistentes a esta droga en Candida albicans y Saccharomyces cerevisiae, ha permitido determinar dos grupos de complementación. El primero de ellos corresponde al factor de elongación 2 (EF2), y el segundo a la proteína del tallo ribosómico P0.
Durante el proceso de elongación de la síntesis de proteínas, EF2 se une al tallo ribosómico de forma reversible, promoviendo la translocación del ribosoma a lo largo del mRNA. La sordarina actúa a este nivel uniéndose al complejo EF2-tallo ribosómico, estabilizándolo en la forma post-translocacional y por tantodeteniendo la elongación del péptido naciente.
Aspergillus fumigatus, un hongo filamentoso patógeno oportunista en humanos, presenta de forma natural resistencia a la sordarina. La dificultad de manipulación de hongos filamentosos en sistemas de rastreo masivos para la búsqueda de nuevos antibióticos nos indujo a construir una cepa de S. cerevisiae que expresara los elementos del hongo que son blanco del inhibidor. En una primera aproximación se clonaron los genes RPP0 y EFTB (homólogo a EFT2) de A. fumigatus, y se expresaron en la levadura para analizar su efecto sobre la sensibilidad a la sordarina.
Se determinó que la expresión de la proteína P0 de A. fumigatus, AfP0, en una cepa de S. cerevisiae que no expresa la proteína P0 endógena, S. cerevisisae dGP0-AfP0, confieren un cierto grado de resistencia a la sordarina. La expresión adicional de EFB en la cepa que expresa la proteína AfP0, S. cerevisiae E4/EFB, mostró una resistencia muy superior. Sin embargo, el crecimiento de la misma era muy lento (tiempo de generación 7 horas), debido al bajo nivel de expresion de EFB y por tanto es poco útil para su utilización en screenings.
Así pues, como alternativa, nos planteamos construir una quimera en la que un fragmento de 220pb del EF2 de S. cerevisiae se sustituyera por el equivalente de EFB que codifica la región que determina la resistencia a la sordarina. Esta quimera se expresó en S. cerevisiae E4 obtiéndose la cepa S cerevisiae E4Q. Esta cepa presenta un tiempo de generación de aproximadamente 3 horas, lo que supone una disminución considerable con respecto a la cepa E4/EFB. Además se ha comprobado que esta cepa presenta un nivel de resistencia a sordarina muy elevado que permitirá su utilización en futuros screenings para buscar compuestos que inhiban A. fumigatus.