rpsL como marcador de selección en Thermus thermophilus.

Blas, E. y Berenguer, J.

Centro de Biología Molecular Severo Ochoa UAM-CSIC lab bc-103. Crta. Colmenar Km 1528049, Madrid. email: ebgalindo@cbm.uam.es

Hoy en día muchos aspectos de los organismos extremófilos están siendo estudiados, entre otros motivos por su potencial aplicación en procesos biotecnológicos e industriales. Uno de los problemas a la hora de desarrollar vectores adecuados para clonar en Thermus thermophilus ha sido la práctica inexistencia de genes de selección positiva a alta temperatura. Uno de los temas a abordar es el desarrollo de cassettes génicos de resistencia termoestable a antibióticos que nos den un mayor margen de trabajo, ya que en la actualidad contamos únicamente con la resistencia termoestable a kanamicina, que permite la selección de mutantes de inserción a alta temperatura y con un índice casi nulo de falsos positivos (1). Recientemente ha sido descrita la "bleomycin binding protein" como marcador de resistencia en Thermus (2), pero aún no se han publicado aplicaciones.

La resistencia en T. thermophilus al antibiótico estreptomicina viene conferida frecuentemente por mutaciones en el gen rpsL, que codifica la proteína S12 de la subunidad 30S del ribosoma bacteriano. La idea de este trabajo era tratar de emplear un gen rpsL mutado como método de selección positiva por resistencia a estreptomicina. Para ello, se aisló el gen rpsL de un mutante espontáneo a estreptomicina en la cepa HB27 de T. thermophilus, comprobándose que la secuencia del gen presenta dos mutaciones (K42R y K52E) en la proteína S12, la segunda de las cuales no había sido descrita previamente. Una vez obtenido este gen mutado, construimos dos tipos de vectores, uno integrativo y otro replicativo, este último basado en el replicón de pMY1 (3), ambos seleccionables por estreptomicina.

La validación del sistema de selección en ambos casos se realizó mediante ensayos de complementación de mutantes de inserción del gen de resistencia a kanamicina con el gen silvestre respectivo (narC, phoA, greA1, greA2) y también mediante genes testigo (b-galactosidasa). Los datos obtenidos de dichos ensayos nos muestran que ambos plásmidos funcionan.

Los ensayos realizados nos han demostrado que el gen rpsL, que confiere resistencia a estreptomicina, es un buen criterio de selección positiva para Thermus thermophilus.

1-Lasa, I.,et al. (1992). Mol. Microbiol. 6(11):1555-64.

2-Brouns, S.J., et al. (2005). J Biol Chem. 280(12):11422-31.

3-de Grado, M., et al. (1998).FEMS Microbiol Lett. 165(1):51-7.