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Instituto de Biotecnología de León (INBIOTEC). Parque científico de León, Avda. del Real, nº 1, 24006. E-mail: degmbi@unileon.es
C. glutamicum es una bacteria Gram + de gran interés industrial debido a su empleo a gran escala en la producción de aminoácidos y vitaminas. La secuenciación completa de su genoma ha permitido avanzar en la búsqueda de genes que se induzcan ante diferentes situaciones de estrés. Así, el objetivo del presente trabajo es el estudio y la caracterización de promotores fuertes regulados por el pH del medio, que permitan la sobreexpresión controlada de genes de interés biotecnológico en corynebacterias.
Tradicionalmente, C. glutamicum es crecido en medios de pH neutro pero inesperadamente en este trabajo se describe por primera vez la condición basófila de este microorganismo, además de la observación de un fenómeno de acomodación al pH. El operón F0F1-ATP sintasa ha sido descrito como implicado en la respuesta a estrés por pH en diversos microorganismos por lo que se decidió estudiar su patrón transcripcional y el efecto que el pH externo ejerce sobre su expresión. Mediante Northern, se analizó la respuesta del operón atp ante distintas condiciones de pH (6.0, 7.0 y 9.0), utilizándose como sondas fragmentos internos a los genes atpI, atpB y atpD (sondas I, B y D, respectivamente). Con la sonda B se obtuvieron dos transcritos de 7.5 kb y 1.2 kb. El primero corresponde al tamaño esperado para la expresión del operón completo, y es claramente inducido a pH 9.0; mientras que el transcrito de 1.2 kb, no inducido por el cambio de pH, corresponde a la expresión del propio gen atpB. Usando la sonda D se confirmó que el mayor transcrito corresponde al cluster de genes atp completo, observándose una banda de 7.5 kb, que se aprecia de nuevo inducida a pH 9.0. Con la sonda I no se obtuvieron señales positivas, por lo que se decidió verificar la existencia de dicho gen y la posibilidad de expresión junto con el operón mediante ensayos de RT-PCR. Los resultados confirman la existencia del gen atpI (banda de 250 pb inducida también a pH 9.0), y que además este gen no forma parte del operón F0F1-ATP sintasa en C. glutamicum, a diferencia de lo que sucede en la gran mayoría de operones atp en otros microorganismos.
Las posibles regiones promotoras del gen atpI y atpB, fueron estudiadas en E. coli y en C. glutamicum mediante su clonación en el vector sonda de promotores pET2, con el cloranfenicol como reporter. Ambas regiones mostraron actividad promotora en dichos microorganismos, alcanzando en C. glutamicum mayor resistencia al cloranfenicol a pHs básicos que a ácidos.
Mediante Primer Extension se ha determinado la existencia de dos sitios de inicio de la transcripción para el operón F0F1, situados en una guanina (G) y en una adenina (A) a 86 pb del ATG inicial del gen atpB y a 45 pb del GTG inicial del gen atpI, respectivamente. A partir del nucleótido +1 se determinaron las cajas -10 y -35 de cada región promotora. Geles bidimensionales han sido utilizados para detectar posibles cambios en el proteoma de C. glutamicum después de un estrés por pH.