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Departamento de Microbiología Molecular, Centro de Investigaciones Biológicas - CSIC, c/ Ramiro de Maeztu, 9, 28040, Madrid.* E-mail: mmoreno@cib.csic.es
La iniciación de la replicación del DNA es un proceso muy complejo que se encuentra regulado en múltiples pasos entre los cuales se incluyen la selección del sitio de inicio en el DNA, el desenrollamiento de la doble hélice y el ensamblaje de la maquinaria multiproteica de replicación. Estudios en la replicación de bacterias, fagos y virus que infectan células eucariotas han establecido que hay proteínas, a las cuales se denomina iniciadoras, que se unen al origen de replicación (el replicador) de una manera específica a esta secuencia.
Al contrario que en procariotas, en donde suele existir un único origen de replicación y una única proteína iniciadora, en eucariotas cada cromosoma necesita múltiples orígenes de replicación para asegurarse que su replicación ocurra en un tiempo preciso. En estos orígenes de replicación (ARS) se une un conjunto de proteínas llamado Complejo de Reconocimiento del Origen (ORC), inicialmente caracterizado en la levadura S. cerevisiae pero posteriormente identificado en todos los eucariotas. ORC es un complejo de seis proteínas (Orc1-Orc6), numeradas en orden de masas decrecientes. Se desconocen los detalles de cómo ORC se ensambla en las ARS, aunque resultados recientes de nuestro grupo [Giraldo, R., Díaz-Orejas, R. (2001) PNAS 98, 4938-4943] planteaban la posibilidad de que fuera un proceso complejo en el cual participen proteínas chaperonas. Mediante ensayos in vitro con proteínas de S. cerevisiae, recombinantes en E. coli y purificadas, hemos identificado la existencia de complejos estables entre chaperonas de la familia Hsp70 y la subunidad Orc4p. Aproximaciones proteómicas y bioinformáticas nos han permitido identificar las superficies de contacto entre DnaK (la chaperona Hsp70 de E. coli) y Orc4p. La mutagénesis dirigida de la secuencia implicada en ORC4 (orc4-Hsp70 box) condujo a una disminución significativa de la agregación de Orc4p y a una asociación más débil con DnaK. Mediante experimentos de dicroismo circular y estudiando las curvas de desnaturalización térmica de Orc4p y el mutante orc4p-Hsp70box, pudimos observar que ambas proteínas no tienen diferencias significativas ni en su estructura secundaria ni en su estabilidad. Además, pretendemos estudiar el efecto de dicha mutación en el ciclo celular y en el disparo de orígenes de replicación in vivo. Hemos desarrollado un sistema de expresión en E. coli del complejo multiproteico ORC con el objetivo de poder estudiar las interacciones de cinco de sus subunidades (ORC1-5), incluyendo bien ORC4 u orc4p-Hsp70box, para tratar de ver cuál interacción (o interacciones) se encuentra afectada por la mutación y para su caracterización biofísica posterior.