Evaluación de los promotores de los genes xlnA y xlnB de Aspergillus nidulans para la producción heteróloga de una ramnosidasa de interés industrial

Tamayo, J.A. y Orejas, M.

Departamento de Biotecnología. Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA). Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). Apartado de Correos 73. 46100 Burjassot (Valencia). juatara@iata.csic.es

Las a-L-ramnosidasas, enzimas ampliamente distribuidas en la naturaleza que catalizan la hidrólisis de la ramnosa terminal presente en los a-L-ramnósidos, tienen un gran potencial en la industria alimentaria donde se pueden aplicar tanto para mejorar la calidad de bebidas (liberando monoterpenos aromáticos en mostos y vinos, o reduciendo el amargor en zumos de cítricos), como sus características funcionales (aumentando la biodisponibilidad de los flavonoides). Pese a este hecho, hasta la fecha no se han descrito estudios para mejorar su producción.

La producción de enzimas heterólogas en cepas recombinantes de hongos filamentosos ha resultado ser una buena estrategia tanto para obtener mejores rendimientos como facilitar su recuperación. Aunque aún no es utilizado normalmente en la industria, A. nidulans es el organismo modelo para llevar a cabo estudios de regulación de la expresión génica, ya que se dispone de todas las herramientas básicas para su manipulación genética y de una amplia batería de mutantes. Estudios anteriores de nuestro grupo, sugerían que los promotores de los genes del complejo xilanolítico, en concreto los de los genes xlnA y xlnB (codifican respectivamente las xilanasas X₂₂ y X₂₂) tienen propiedades adecuadas para sobreexpresión regulada de genes heterólogos. La actividad de los genes xlnA y xlnB está controlada, a nivel transcripcional, por al menos tres proteínas reguladoras: (i) CreA, que reprime su expresión en presencia de glucosa; (ii) XlnR, que activa específicamente su expresión cuando xilano o xilosa son la fuente de carbono; y (iii) PacC, que los regula de manera diferente en función del pH ambiental. Mientras que la expresión del gen xlnA es mayor a pH alcalino y más aún en fondos genéticos mutantes pacC^c (mimetizan las condiciones de crecimiento alcalino), la expresión de xlnB es mayor en medios ácidos y más aún en fondos genéticos mutantes pacC^+/- o pal^- (mimetizan el crecimiento a pH ácido). El hecho de que la transcripción de estos genes sea mayor en esos mutantes, así como en mutantes creA^d30 y xlnR^c, indica un camino a seguir para llevar a cabo una mejora genética dirigida de cepas para la sobreproducción de enzimas.

Nuestro objetivo final es conocer, en A. nidulans, el efecto que tienen sobre la producción de ramnosidasa el tipo de promotor, el número de copias, el fondo genético y las condiciones ambientales. En el presente trabajo se compara la cinética de producción de la a-L-ramnosidasa A (codificada en Aspergillus aculeatus por el gen rhaA) en cepas portadoras de una copia de los cassettes de expresión xlnA_p::rhaA y xlnB_p::rhaA, integradas en los locus xlnA y xlnB respectivamente, con la de cepas mutantes pacC^C14, xlnA_p::rhaA y palA1, xlnB_p::rhaA.

Trabajo financiado por el proyecto AGL2002-01906 (CICYT/FEDER).