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*Departamento de Microbiología II. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid. 28040 Madrid. **Division of Cell Biology, Hospital for Sick Children, Toronto, Ontario M5G 1X8, Canadá.
SigD (SopB) es una proteína de Salmonella inyectada en las células del huésped a través de un sistema de secreción tipo III, dependiente de la Isla de Patogenicidad 1 (SPI-1). SigD contribuye, junto a otros efectores dependientes de SPI-1 (SopE/E2, SipA y SipC) a la invasión de células no fagocíticas actuando sobre el citoesqueleto de actina y flexibilizando la membrana para facilitar la endocitosis (1). Los efectos de SigD se han atribuido a su actividad como fosfatasa de fosfatidil-inositol polifosfatos. La reorganización de actina supone una activación de proteínas G pequeñas de la familia Rho, como Cdc42 o Rac-1. La activación por SopE/E2 es directa, pero en el caso de SigD se atribuye indirectamente a su actividad fosfatasa. Sin embargo, en nuestro laboratorio se ha podido disociar su efecto sobre actina de la actividad enzimática, y localizar una región esencial en un dominio posiblemente implicado en unión a membranas (2). En consecuencia, decidimos analizar la activación de Rac-1 y Cdc42 por SigD y construcciones derivadas de ella.
Para ello se utilizaron vectores que expresaban las versiones dominantes silvestres y mutantes negativos de Rac-1 y Cdc42, fusionadas al epítopo Myc, para co-transfectar células HeLa conjuntamente con plásmidos que expresaban SigD o sus derivados mutagenizados, fusionados a la proteína GFP. De este modo se pudo detectar por microscopía confocal la localización de las proteínas Rho en membrana como consecuencia de su activación in vivo.
SigD fue capaz de activar Rac-1-myc, mientras que el mutante SigDR468A deficiente en actividad fosfatasa mostró una capacidad de activación reducida pero significativa. Este resultado concuerda con las observaciones sobre el efecto de SigD y SigDR468A sobre el citoesqueleto de levaduras y células HeLa (2). Por el contrario, la activación de Cdc42-myc, tanto con la proteína silvestre SigD como con el mutante SigDR468A, no fue significativa. Por lo tanto, hay indicios de que SigD, aunque no interaccione directamente con Rac-1, puede activarla por una vía independiente de su actividad fosfatasa.
Se ha utilizado también la microinyección de los vectores en células de mamífero, que permite una expresión más rápida de las construcciones, para analizar su papel en la formación de vacuolas y “ruffles” y su posible relación con las rutas de trafico endocítico, detectando la co-localización con anticuerpos anti-EEA1 y Lamp1.
(1) Terebiznik MR, et al. Nat Cell Biol. 4:766-73.
(2) Alemán A, Rodríguez-Escudero I, Mallo GV, Cid VJ, Molina M, Rotger R. Cellular Microbiology (aceptado).