Estudios de secreción de la haloproteasa CP1 producida por Pseudoalteromonas ruthenica CP76

Sánchez-Porro, C., Mellado, E. y Ventosa, A.

Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla. sanpor@us.es

Los microorganismos halófilos moderados son capaces de crecer óptimamente en medios que contienen de 0,5 a 2,5 M (aprox. 3-15%) de NaCl. Estos microorganismos son muy interesantes desde un punto de vista biotecnológico ya que producen numerosos compuestos de interés industrial como exopolisacáridos, solutos compatibles o enzimas (Ventosa y col., 1998). La bacteria halófila moderada Pseudoalteromonas ruthenica CP76 fue aislada en un screening realizado en salinas de Isla Cristina (Huelva), en el que se determinó la capacidad de las bacterias halófilas para producir diferentes hidrolasas extracelulares (Sánchez-Porro y col., 2003a). P. ruthenica CP76 produce una proteasa extracelular, denominada haloproteasa CP1, que ha sido purificada y caracterizada bioquímicamente (Sánchez-Porro y col., 2003b).

Mediante PCR inversa se ha secuenciado el gen, denominado cp1, que codifica dicha proteasa. Se trata de una proteína de 733 aminoácidos que se sintetiza en forma de pre-proproteína con cuatro dominios conservados. Corriente abajo del gen cp1 se ha encontrado otro gen, cp2, que codifica una segunda proteasa extracelular.

El sistema general de secreción (GSP) es un mecanismo de translocación mediante el cual las proteínas atraviesan sucesivamente, la membrana citoplasmática y la membrana externa (Sandkvist, 2001). Para que una proteína atraviese la membrana interna las bacterias utilizan generalmente el sistema Sec mientras que para atravesar la membrana externa el mecanismo más comúnmente utilizado por las bacterias Gram-negativas es el denominado de tipo II. El aparato de secreción de tipo II está compuesto por 12-16 genes diferentes que forman un complejo multiproteico localizado en el espacio periplásmico. La proteína D es una de las proteínas más conservadas en este tipo de secreción y es la encargada de formar el poro en la membrana externa. En este trabajo se ha amplificado, mediante PCR inversa, el gen que codifica la proteína D en P. ruthenica CP76. Además, mediante mutagénesis por doble recombinación utilizando el cassette wSm y el vector suicida pJQ200-SK se ha conseguido un mutante, P. ruthenica CP77, incapaz de secretar la haloproteasa CP1 al exterior, confirmando por tanto que en esta bacteria la haloproteasa CP1 es secretada al exterior mediante el sistema de tipo II.

C. Sánchez-Porro, S. Martín, E. Mellado and A. Ventosa. 2003a. Diversity of moderately halophilic bacteria producing extracellular hydrolytic enzymes. J. Appl. Microbiol. 94: 295-300.

C. Sánchez-Porro, E. Mellado, C. Bertoldo, G. Antranikian and A. Ventosa. 2003b. Screening and characterization of the protease CP1 produced by the moderately halophilic bacterium Pseudoalteromonas sp. strain CP76. Extremophiles 7: 221-228.

Sandkvist, M. 2001. Biology of type II secretion. Mol. Microbiol. 40: 271-283.

A. Ventosa, J.J. Nieto and A. Oren. 1998. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 504-544.