Interacciones entre la lipasa de Candida rugosa y bicapas lipídicas mediante  Microscopía de Fuerzas Atómicas. Aplicación para el estudio de inhibidores de lipasas

Prim N.^a, Iversen L.^b, Bjørnholm T. ^b y Diaz P.^a

^aDepartamento de Microbiología, Universidad de Barcelona, Avda. Diagonal 645, Barcelona 08028, e-mail: nprim@ub.edu. ^bNano Science Center, Department of Chemistry, University of Copenhagen, Universitetsparken 5, DK-2100 Copenhagen, Dinamarca

Las lipasas microbianas son enzimas altamente versátiles, mostrando gran eficacia en múltiples conversiones biotecnológicas [1]. Algunas de ellas se han considerado también como factores de virulencia para el establecimiento y/o mantenimiento de ciertos procesos patogénicos [2]. Debido a la complejidad de las propias lipasas y de los sustratos sobre los cuales actúan, resulta extremadamente importante conocer las interacciones moleculares que se establecen entre ambos, para entender el modo particular de acción de estas enzimas bajo diferentes condiciones de reacción. Adicionalmente, el estudio de sustancias potencialmente inhibidoras de lipasas está ganando interés, especialmente dirigido hacia aquellas enzimas producidas por microorganismos que contribuyen a ciertas enfermedades como el acné o la úlcera gástrica [3].

La microscopía de fuerzas atómicas (AFM) supone un nuevo enfoque para el estudio de sistemas biológicos complejos a nivel molecular, ya que permite la observación in situ de reacciones e interacciones moleculares en las interfases, y bajo condiciones cercanas a las fisiológicas [4]. Además, la microscopía de fuerzas atómicas puede medir interacciones específicas entre una enzima y dos ligandos, uno de ellos en solución y el otro inmovilizado sobre una superficie [5], permitiendo de este modo el estudio de sistemas multicomponente [6]. En este contexto, se prepararon bicapas lipídicas de DPPC-MPG (Dipalmitoilfosfatidilcolina y Monopalmitoilglicerol) sobre mica mediante la técnica de Langmuir-Blodgett [4] y se utilizó la microscopía de fuerzas atómicas para el estudio de las interacciones establecidas entre las lipasas y estas interfases. La lipasa de Candida rugosa (CRL) [7], por tratarse de una enzima muy bien caracterizada, fue usada como modelo para estandarizar las condiciones generales para estos estudios a nanoescala. En los ensayos con CRL en solución, se monitorizó la hidrólisis del MPG mediante observación del incremento del tamaño de los pequeños defectos estructurales presentes en las bicapas originales. Por otro lado, se realizaron estudios de las fuerzas establecidas entre las bicapas y la enzima previamente unida a la sonda de AFM, obteniéndose curvas de fuerzas indicativas de estas interacciones moleculares. Los estudios de AFM en presencia de compuestos anteriormente descritos como inhibidores de lipasas con potencial terapéutico [6, 8], se están llevando a cabo en la actualidad.

[1] Jaeger, K.E., Ransac,S., Dijkstra, B.W., Colson, C., Heuvel., M., Misset, O. (1994). FEMS Microbiol. Rev. 15: 29-63. [2] Jaeger, K.E., Reetz, M.T. (1998). TIBTECH, 19: 396-403. [3] Higaki, S. (2003). Journal of molecular catalysis B Enzymatic, 22 (5-6): 377-384. [4] Balashev, K., Jensen, T.R., Kjaer, K., Bjørnholm, T. (2001). Biochimie, 83: 387-397. [5] Fiorini, M., McKendry, R., Cooper, M.A. Rayment, T., Abell, C. (2001). Biophysical Journal, 80: 2471-2476. [6] Allen, S., Davies, J., Dawkes, A.C., Davies, M.C., Edwards, J.C., Parker, M.C., Roberts, C.J., Sefton, J., Tendler, S.J.B., Williams, P.M. (1996). FEBS Letters, 390: 161-164. [7] Sailas, B. , Ashok, P. (1998). Yeast , 14: 1069-1087. [8] Ruiz, C., Falcocchio, S., Xoxi, E., Pastor, F.I.J., Diaz, P., Saso, L. (2004). Biochimica et Biophysica Acta  1672: 184-191.