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Departamento de Microbiología, Universidad de Barcelona, Av. Diagonal 645, 08028 Barcelona, España. e-mail: picart@bio.ub.es
La cepa fúngica Stachybotrys atra BP-A fue aislada a partir de material textil en descomposición, e identificadamediante el estudio del operón nuclear rDNA. El estudio del sistema celulolítico de la cepa mediante electroforesis y zimograma mostró que la cepa posee una batería compleja de enzimas celulolíticos, en relación con su capacidad de crecer en medios de celulosa como única fuente de carbono. Con el fin de caracterizar de forma más completa el sistema celulolítico de Stachybotrys atra BP-A, se realizaron ensayos de unión de dichas enzimas a celulosa cristalina (Avicel), para determinar la capacidad de unión de las distintas celulasas al Avicel y poder establecer así estrategias para la purificación de las mismas. Los resultados mostraron que las celulasas de peso molecular 61 y 63 kDa se unían a Avicel, hecho que indicaba la presencia de dominios de unión a celulosa (CBM) en estas enzimas, mientras que las celulasas de peso molecular 59 y 40 kDa no se unían a celulosa y se recogían en la fracción no unida a Avicel. Los ensayos para determinar las condiciones de elución de las dos celulasas que se adsorben al Avicel mostraron que, de entre todos los eluyentes analizados, únicamente el SDS al 1% consiguió la elución de ambas celulasas.
Al mismo tiempo, con el fin de clonar las celulasas en estudio, se diseñaron 2 primers degenerados correspondientes a una región conservada de las endoglucanasas de la familia 12 de glicosil hidrolasas, familia que contiene celulasas fúngicas con interesantes aplicaciones industriales (Goedegebuur, et al., 2002). Mediante dichos primers se amplificó un fragmento que contenía una secuencia codificante con similitud a endoglucanasas fúngicas. A continuación, mediante la técnica de gene walking, se consiguió la secuencia completa del gen, que codificaba para un enzima que presentó un 85% de homología con una endoglucanasa de la sp. Memnoniella echinata. Dicha enzima se denominó Endoglucanasa A.
Actualmente se están llevando a cabo geles 2D, secuenciación del extremo N-terminal y FPLC con el fin de clonar el resto de celulasas de Stachybotrys atra BP-A.
Goedegebuur, F., Fowler, T., Phillips, J., Pim van der Kley, Piet van Solingen, Dankmeyer, L. And Power, S. (2002). Cloning and relational analysis of 15 novel fungal endoglucanases from family 12 glycosyl hydrolase. Current Genetics 41:89-98.