Ensayos de expresión heteróloga del gen as-48A cíclicamente permutado que contiene la secuencia lineal del péptido AS-48

Montalbán, M., Martínez-Bueno, M., Valdivia, E. y Maqueda, M.

Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias. Universidad de Granada. Campus Fuentenueva s/n 18071 Granada. manuelml@ugr.es

La enterocina AS-48 producida por Enterococcus faecalis, es una molécula singular por las características estructurales que presenta -un péptido circular mediante enlace peptídico entre sus residuos terminales (Met¹Tyr⁷⁰), organizada en cinco hélices a las cuales presentan una estructura globular muy compacta- y por el amplio espectro de acción que muestra frente a la mayoría de bacterias Gram-positivas ensayadas y algunas especies de Gram-negativas. Para profundizar en la relación estructura/función hemos diseñado la obtención de una molécula de AS-48 lineal que nos permita investigar la importancia de la ciclación en la estabilidad de la molécula.

En este trabajo se ha construido un nuevo gen mediante permutación cíclica del gen estructural (as-48A) que codifica una variante lineal de la molécula AS-48, abierta por el asa de giro existente entre las hélices a3 y a4 (AS-48L^3-4). El sitio de apertura ha sido cuidadosamente diseñado en base a análisis teóricos y estructurales para identificar la zona de mayor flexibilidad, con la finalidad de que la nueva molécula conserve las características estructurales y biológicas de la nativa. Este gen ha sido clonado en el vector pBAT-4m bajo el promotor lacUV5 que responde a la inducción por IPTG (isopropil-b-D-tiogalactopiranósido), y la construcción obtenida (pBAT4-L^3-4) ha sido empleada para transformar las cepas BL21 y DH5a de E. coli.

La presencia de las moléculas lineales AS-48L³⁴ ha sido extensamente investigada en los lisados de las células transformadas y de los correspondientes controles negativos, tras la inducción con concentraciones variables de IPTG a distintos tiempos y temperaturas, en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Sin embargo, no ha sido posible la detección de proteínas con el tamaño esperado (7149.5 Da) en ninguna de las condiciones ensayadas. Este resultado sugiere que la molécula lineal podría ser inestable y por ello rápidamente degradada por proteasas celulares, o alternativamente que fuera tóxica para la célula, lo que explicaría el retraso de varias horas observado en el inicio del crecimiento de los transformantes tras la inducción con IPTG.