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1Dpto. de Microbiología. Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Pamplona y 2Unidad de Sanidad Animal, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria, Gobierno de Aragón, Zaragoza, España.
La envoltura de Brucella se diferencia de la de la mayoría de los patógenos animales por contener fosfatidilcolina (PC), el fosfolípido más abundante en la membrana de eucariotas, donde tiene un papel estructural importante y puede intervenir en la señalización. Aunque el papel de la PC en la patogenicidad de Brucella no ha sido investigado todavía, podría ser relevante en la estrecha relación que la bacteria mantiene con la célula hospedadora. Se han descrito dos rutas principales para la síntesis de PC. En la primera, la PC se forma por metilaciones de la fosfatidil-etanolamina realizadas por una metiltransferasa (PmtA) que utiliza la S-adenosilmetionina como dador. La segunda está mediada por una PC sintasa (Pcs) que condensa colina con CDP-diacilglicerol para formar PC. El genoma de Brucella contiene dos ORFs con homología significativa con las de PmtA y Pcs. Nuestro trabajo ha sido analizar si estas ORFs están implicadas en la producción de PC y estudiar el papel de este fosfolípido en las propiedades de la membrana de Brucella y en la virulencia en ratones.
Por mutagénesis dirigida se construyeron mutantes no polares en pmtA (BApmtA), en pcs (BApcs) y un doble mutante pmtApcs (BApmtApcs) en B. abortus 2308. El análisis por cromatografía en capa fina de alta resolución mostró que el mutante pcs y el doble mutante pmtApcs no sintetizan PC. La síntesis de PC se restableció cuando ambos fueron complementados en trans con el gen pcs. Además, la introdución de un plásmido con pmtA no indujo la síntesis de PC en el doble mutante. Estos resultados sugieren que, in vitro, la vía de la Pcs es la única implicada en la síntesis de PC en B. abortus, y que cuando está anulada tampoco la sobreexpresión de pmtA conlleva la síntesis de PC. Los mutantes BApcs y BApmtApcs crecieron más despacio que la cepa parental y fueron más sensibles a la poly-L-ornitina. Por otra parte, los tres mutantes se diferenciaron de la cepa parental por su sensibilidad a colorantes y al fago Tb.
Los estudios de virulencia en ratones demostraron que los mutantes pcs y pmtApcs se multiplican menos y son menos persistentes que la cepa parental. Esto demuestra que la PC es un componente de B. abortus necesario para establecer infecciones crónicas. Inesperadamente, el mutante pmtA también se multiplicó y persitió menos que la cepa parental, indicando que juega un papel desconocido in vivo también necesario para la cronicidad. Se postula que una estabilidad de la membrana externa de Brucella necesaria para un nivel máximo de virulencia sólo pude ser proporcionada por la PC y no por la fosfatidil-etanolamina como en la mayoría de los patógenos gram-negativos.