Recombinación no homóloga (NHEJ) en Candida albicans: caracterización de mutantes HDF-1D.

Chico, L., Ciudad, T. , Larriba G. y Andaluz, E.

Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, Badajoz. lychic@gmail.com

Candida albicans es un hongo patógeno oportunista de gran interés por ser un agente causante de infecciones fúngicas en el ser humano. La característica más estudiada de C. albicans es su diformismo que se produce como respuesta a las condiciones ambientales y se cree relacionado con la virulencia del microorganismo. Otras características destacables de este microorganismo son su diploidía y la ausencia de ciclo sexual completo, no pudiendo generar variabilidad genética mediante meiosis como otros hongos. Se estima que se adapta al estrés y a las condiciones ambientales del huésped mediante cambios genéticos, aprovechando su carácter diploide. Estos cambios surgen como consecuencia de la reparación de roturas de la doble cadena (DSBs, Double Strand Breaks), la cual es llevada a cabo por diferentes vías, siendo las más importantes, la recombinación homóloga (HR) y el mecanismo de reparación por unión de extremos no homólogos o NHEJ (Non Homologous End Joining).

Con objeto de entender esta inestabilidad genética, estamos generando diversos mutantes mediante la disrupción de distintos genes implicados en ambas rutas. Estudios previos se han centrado en los genes RAD52 (implicado en HR) y LIG4 (implicado en NHEJ). En el presente trabajo, hemos caracterizado el gen HDF-1, implicado en NHEJ.

En Saccharomyces cerevisiae, la proteína Hdf-1 (Ku70) forma un heterodímero con Ku80 que, a su vez, constituyen, junto con DNA-PK_CS, un complejo proteico que desempeña un papel central dentro de la ruta NHEJ. A este complejo se le atribuyen distintas funciones como la protección de los extremos de DNA frente al ataque de exonucleasas o, bien, mantener inaccesible a la maquinaria implicada en los procesos de replicación y transcripción del DNA, evitando transferencias en la reparación.

En C. albicans, hemos detectado un gen, CaHDF-1, que codifica para una proteína homóloga a Ku70 de S. cerevisiae. Hemos obtenido mutantes nulos mediante la interrupción secuencial de ambos alelos en la cepa CAI4 (auxótrofo para el gen URA3) utilizando el método URA blaster. Con el mismo método, se han realizado las construcciones de mutantes nulos hdf-1/hdf-1 en fondo lig4/lig4 y mutantes nulos rad52/rad52 en fondo hdf-1/hdf-1. Los mutantes generados serán sometidos a un análisis fenotípico básico, que incluye capacidad de miceliación, sensibilidad a daño al DNA (UV, MMS) y aparición espontánea de auxotrofías. Actualmente, estamos clonando CaHDF-1 a partir de un fósmido utilizado en la confección del mapa físico del genoma.