M - 45
1. Área de Microbiología, Facultad de Biología y Ciencias Ambientales, 24071, León, España. 2. Instituto de Biotecnología, INBIOTEC, Parque Científico de León, León, España.
La fenilacetil-CoA ligasa de Penicillium chrysogenum es una acil-CoA-ligasa específica que cataliza la activación del ácido fenilacético (PAA) a fenilacétil-CoA (PAA-CoA), en presencia de ATP, CoA e iones de magnesio. Dicha activación es necesaria para que el ácido fenilacético sea utilizado como precursor de la cadena lateral en la biosíntesis de bencilpenicilinas. Esta enzima pertenece a la familia de enzimas que forman los aminoacil-adenilato.
En el presente trabajo se ha clonado el gen que codifica para la fenilacetil-CoA ligasa (phl) y la proteína deducida, (Phl) posee un 65 % de identidad con una proteína hipotética (AN7631.2) de Aspergillus nidulans y entre un 30% y un 35% con otras tres proteínas también hipotéticas (AN2549.2, AN3490.2 y AN5990.2) del mismo hongo, alrededor de un 50 % de identidad con proteínas hipotéticas de Neurospora crassa y Magnaporthe grisea y un 30 % de identidad con las 4-cumarato-CoA ligasa de varias plantas superiores.
Los genes que intervienen en la ruta de biosíntesis de penicilinas en P. chrysogenum se agrupan formando un único cluster; mediante experimentos de hibridación, se determinó que el gen phl no forma parte de dicha agrupación génica.
Para analizar la implicación de Phl en la biosíntesis de penicilina se ha llevado a cabo el incremento de la dosis génica (cepa Phl+) y la interrupción del gen phl (cepas Phl1- y Phl2-). En el caso de Phl+ se observó un aumento de un 30 % en la biosíntesis de penicilina respecto a la cepa silvestre Wis54, mientras que las cepas Phl1- y Phl2-, crecidas en medio definido con 0.15 % de fenilacetato potásico producían un 35 % menos de penicilina que la cepa silvestre. La cepa Phl+ es resistente a concentraciones más altas de fenilacético y las cepas interrumpidas son más sensibles.
Posteriormente se utilizaron extractos proteicos crudos de Wis54, Phl+ y Phl1- para analizar in vitro la reacción de conversión del PAA en PAA-CoA. Mediante técnicas de HPLC se midió la formación de PAA-CoA observandose que en la cepa Phl+ se producía un aumento de aproximadamente 8 veces respecto a la parental Wis54, mientras que en la cepa interrumpida Phl1- se detectó un descenso en la actividad enzimática de alrededor un 35 % respecto aWis54.
Estos resultados indican la implicación de la proteína Phl en la biosíntesis de penicilina y sugieren la probable existencia de otra proteína capaz de catalizar la activación del ácido fenilacético a fenilacetil-CoA.