Identificación de un represor del promotor del operón de la ATPasa F₀F₁ de Streptococcus pneumoniae

Hernández-Madrid, A.¹ y de la Campa A. G.

Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, 28220 Majadahonda, Madrid. ¹v72hemaa@isciii.es

La principal función de la ATPasa F₀F₁ de Streptococcus pneumoniae es mantener el pH intracelular a partir de la hidrólisis de ATP [1]. Esta enzima está codificada por un operón esencial para la viabilidad celular [2]. La regulación de la transcripción de la ATPasa F₀F₁ está mediada por una secuencia de 90 nucleótidos (-90 a +1 del gen atpC, primer gen del operón) [1]. Para estudiar la regulación del promotor del operón de la ATPasa F₀F₁ (Patp) se intentó clonar en el plásmido pLS1 (de neumococo) una fusión Patp(-90-+1)-cat, pero todos los plásmidos recombinantes obtenidos presentaron mutaciones y deleciones en Patp, entre la región -35 y el inicio de la transcripción. Dicha región podría ser la zona de unión del factor regulador, que se habría delecionado en los plásmidos para evitar su titulación, ya que el número medio de copias de pLS1 es de 40/célula y la cantidad de represor presente en la célula sería limitada. A continuación se introdujo la fusión Patp-cat en el cromosoma de S. pneumoniae R6, originándose la cepa R6-CAT3.10 que se utilizó como receptora de una genoteca de R6 en pLS1. Para detectar clones recombinantes portadores de un posible activador, se plaqueó la genoteca seleccionándose en cloranfenicol, a concentración superior a la CMI de R6-CAT3.10. En una genoteca representativa no se obtuvo ningún clon recombinante con estas características. Posteriormente, para detectar clones de la genoteca que llevasen un represor, se hicieron réplicas de las colonias en placas con y sin cloranfenicol, a concentración inferior a la CMI de R6-CAT3.10. Se seleccionaron 5 clones que no crecieron en presencia del antibiótico, pero solamente uno de ellos tenía una acción represora específica sobre Patp, el clon pLATP5: la actividad cloranfenicol acetil transferasa de cepas con la fusión cromosómica Patp-cat disminuyó únicamente en cepas con Patp silvestre, pero no con Patp mutado. El plásmido pLATP5 llevaba un inserto con dos genes completos, spr1552 y spr1551, que podrían constituir un operón. Se obtuvo represión de Patp silvestre cuando el plásmido era portador del operón completo (spr1552-spr1551) o bien del gen spr1552. Otro dato independiente que apoya el papel represor del operón spr1552-spr1551 es la disminución en 2.6 veces de los niveles de sus mRNAs a pH ácido [3]. Por tanto, el incremento en la transcripción de la ATPasa F₀F₁ a pH ácido podría deberse a una disminución en la cantidad de represor.

1.Martín-Galiano, A.J., M.J. Ferrándiz, and A.G. de la Campa. Mol. Microbiol., 2001. 6: p. 1327-1338.

2.Ferrándiz, M.J. and A.G. de la Campa. FEMS Microbiol. Lett., 2002. 10514: p. 1-6.

3.Martín-Galiano, A.J., K. Overweg, M.J. Ferrándiz, M. Reuter, J. Wells and A.G. de la Campa. (Manuscrito en preparación), 2005.