Clonaje, expresión, purificación y determinación de la actividad enzimática de pbp4b de Escherichia coli

Vega Mendoza D.E.* y Ayala Serrano J.A.

Centro de Biología Molecular Severo Ochoa de Madrid- Universidad Autónoma de Madrid-Campus Cantoblanco-28049*dvega@cbm.uam.es

Las Penicillin-Binding Proteins (PBPs), enzimas responsables del ensamblaje y maduración del peptidoglicano a través de actividades DD-Transpeptidasa, Transglicosilasa, DD-Carboxipeptidasa y DD-endopeptidasa, son investigadas como posibles dianas antimicrobianas dado su carácter de ser altamente específicas, selectivas y esenciales, entre ellas podemos destacar una nueva PBPB4b, descubierta por nuestro grupo de trabajo.

Se realizo el clonaje del gen pbp4b de E. coli CS-109 en pET28b y se transformó en células competentes Bl21 (DE3).La expresión de PBP4b se realizó utilizando medio M9 con kanamicina 30 µg a 21ºC e inducción con 1 mM IPTG. Para la purificación, las membranas fueron extraídas con Sarkosil 0,2%/4ºC/12 horas, y se ultracentrifugo 30 minutos/70000 rpm/ 4ºC. Este extracto se incubo a 4ºC/1 hora con agarosa Ni-NTA y se eluyó con imidazol 250 mM y finalmente se dializó y verificó por SDS-PAGE y Western-Blot.

A fin de determinar la capacidad de unión a penicilina de PBP4b, se realizaron ensayos de "Binding" a Bocillin-FL, usando membranas de BL21(DE3)/pET28b-PBP4b obtenidas en condiciones de inducción y no inducción por IPTG. Los resultados obtenidos muestran claramente que PBP4b es una Penicillin-Binding Protein.

Los ensayos dirigidos a detectar la posible actividad Carboxipeptidasa (CPasa) y/o Endopeptidasa (EPasa), se han enfocado desde el análisis por HPLC del peptidoglicano de BL21(DE3)/pET28b-PBP4b no inducido e inducido por IPTG crecidos en M9 a 21 y 37ºC, los resultados obtenidos muestran una variación en la composición de muropeptidos, apreciándose una reducción en los pentapeptidos diméricos (en caso de inducción por IPTG), lo cual indica una posible actividad CPasa especifica sobre los dímeros pentapeptídicos. Estos resultados se verificaron en las condiciones de 21 y 37ºC en LB.

Otro enfoque realizado (modificación de la técnica de Ghursen et.al,) fue la liberación de D-Ala empleando 375 nmoles de Na, Ne-Diacetyl-Lys-D-Ala-D-Ala como sustrato, y detectado por absorción a 460 nm. Los resultados obtenidos muestran que PBP4b libera 2 nanomoles de D-Alanina en una hora a 37 ºC en condiciones de saturación de sustrato, lo cual nos permite concluir que PBP4b, presenta una actividad DD-CPasa debil, en las condiciones de ensayo utilizadas.

Otra estrategia que estamos llevando a cabo actualmente para determinar la posible actividad CPasa y/EPasa de PBP4b es el análisis por HPLC de los productos de la reacción in vitro, empleando como sustratos los muropeptidos M5 (monomero pentapeptido) y D45 (dimero tetra-pentapeptido).Todos los datos sugieren que PBP4b presenta una actividad CPasa especifica sobre dímeros.