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Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, Málaga 29071. e-mail: diegor@uma.es
El oídio es una enfermedad de origen fúngico común en cultivos de cucurbitáceas que puede ser causada por dos especies, Golovinomyces cichoracearum o Podosphaera fusca, siendo éste el único agente responsable de la enfermedad descrito en el sur de España. Las dos principales estrategias de control de la enfermedad, el empleo de cultivares resistentes y el uso intensivo de fungicidas, presentan limitaciones en su eficacia. En este escenario, el control biológico ha surgido como una interesente alternativa que puede paliar algunas de estas deficiencias contribuyendo a mejorar el control de la enfermedad. Puesto que P. fusca es un hongo biotrofo con desarrollo ectoparasítico, asumimos que éste podría ser eficazmente controlado por microorganismos productores de antibióticos. En nuestro laboratorio se han aislado 4 cepas de Bacillus subtilis que han demostrado capacidad de reducir el desarrollo de P. fusca en ensayos de biocontrol con células lavadas tanto in vitro como en plántula. Paralelamente la capacidad inhibitoria observada para los filtrados libres de células en ensayos de biocontrol in vitro contra P. fusca señalaba a la antibiosis como principal mecanismo de acción de estas cepas. Con el objetivo de corroborar esta hipótesis, se planteó llevar a cabo la identificación de los posibles compuestos antifúngicos producidos, así como el análisis de mutantes deficientes en su producción.
Para el análisis de las sustancias antifúngicas producidas se realizó una extracción con n-butanol, fraccionamiento mediante cromatografía FLASH y purificación mediante HPLC preparativa. El empleo de técnicas analíticas como TLC, HPLC, espectrometría de masas (MALDI-TOF), análisis de infrarrojos y el análisis de la composición y secuencia de aminoácidos nos permitieron confirmar que las 4 cepas producían surfactina, fengicina y bacilomicina o iturina, lipopéptidos ya descritos en diferentes cepas de Bacillus y con demostrada capacidad antifúngica. La actividad antioídio de cada lipopéptido fue evaluada in vitro, midiendo el porcentaje de germinación de esporas de P. fusca y mientras que la surfactina no lo reducía significativamente, fengicina y bacilomicina retenían la mayor capacidad inhibitoria entre un 55% y 63% respecto a la observada para el sobrenadante (88%). La obtención de mutantes deficientes en la producción de lipopéptidos se está llevando a cabo mediante mutagénesis dirigida, para lo cual hemos construido una colección de vectores de integración que portan una secuencia entre 300-2000 pb del gen diana así como un marcador de resistencia para Bacillus. La imposibilidad para transformar estas cepas con las técnicas descritas nos ha llevado a poner a punto una nueva estrategia de transformación con la que se han obtenido mutantes que están siendo evaluados mediante HPLC para confirmar la no producción de los lipopéptidos. Igualmente, se llevará a cabo una caracterización molecular de estos mutantes (PCR y southern blot), así como de su actividad biológica, mediante ensayos de biocontrol in vitro contra oídio.