¿Fitoquelatinas en ciliados?: Aislamiento, clonación, caracterización y análisis de la expresión de un gen que codifica una  fitoquelatin-sintasa en Tetrahymena thermophila.

Amaro Torres, F., Martín-González, A. y  Gutiérrez J.C.

Departamento de Microbiología-III. Facultad de Biología. C/. José Antonio Novais, 2. Universidad Complutense (UCM). 28040 Madrid.  E-mail: juancar@bio.ucm.es

La fitoquelatin-sintasa (FQS) (g - glutamilcisteinil-transferasa ; EC: 2.3.2.15) es la enzima encargada de la biosíntesisde fitoquelatinas (FQs) (g - Glu-Cys)n-Xaa, donde n = 11-12. Este oligopéptido, junto con el glutatión (GSH), sustrato de la FQS, y las metalotioneinas (MTs), son las principales moléculas involucradas en la destoxificación de metales pesados (MPs). Se han detectado FQs en muchas plantas, algunos hongos, en la levadura Schizosaccharomyces pombe y en el nematodo Caenorhabditis elegans. En todos ellos se ha identificado, igualmente, un gen codificante de FQS.

Usando cebadores diseñados a partir de regiones conservadas de secuencias de FQS de diversos organismos, pudimos amplificar por PCR un fragmento, a partir de ADN genómico del ciliado T. thermophila (cepa SB1969), que presentaba homología con FQS de otros organismos. A partir de este fragmento, y aprovechando que el genoma-macronuclear de este ciliado está completamente secuenciado, identificamos la sección del genoma secuenciado en donde se encuentra dicho gen. Usando los cebadores apropiados se ha podido clonar y secuenciar el gen completo. Este gen tiene una longitud de 2.615 b y presenta 3 intrones (129, 79 y 1.069 b, con % de A+T; 83, 92 y 84%, respectivamente). La región codificante completa tiene una longitud de 1.341b, y origina una proteína de 446 aa con una masa molecular estimada de 52,4 Kda (dentro del rango 45-55 Kda que presentan todas las FQS eucariotas conocidas). Presenta una identidad del 41% con la FQS de Caenorhabditis, un 39% con la de Schizosaccharomyces y la FQS1 de Arabidopsis thaliana, y un 38% con la de Brassica juncea. El extremo N-terminal de la proteína es el que tiene el centro catalítico, y es el más conservado; la FQS de Tetrahymena presenta, en este extremo, los tres residuos; Cys, His y Asp, que en todas las FQS están muy conservados y forman la triada catalítica del centro reactivo. Por RT-PCR, hemos aislado el ADNc correspondiente a este gen, el cual se expresa constitutivamente en poblaciones control del ciliado y en poblaciones expuestas a Cd²⁺ (24 h). Al igual que otras FQS, no parece existir una sobre-expresión del gen en presencia del MP, al contrario de lo que sucede con MTs de este ciliado. Aún no hemos podido detectar FQs (el producto de esta enzima) en T. thermophila, sin embargo la expresión de este gen hace posible (siempre que la FQS se comporte como tal) la presencia de FQs en este microorganismo. Esta es la primera vez que se detecta una FQS en un protozoo ciliado (organismo con biología de tipo animal), e, igualmente, es la primera vez que surge la posibilidad de existencia de FQs en ciliados.

(Financiado por el proyecto BOS2002-01067, I+D, MEC).