V - 50
Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, Campus Universitario Teatinos, s/n. 29071 Málaga. jjborrego@uma.es
La enfermedad de linfocistis es una de las enfermedades piscícolas más frecuentes en las instalaciones mediterráneas de acuicultura marina. Su agente causal es el virus de la enfermedad de linfocistis (LCDV), miembro del género Lymphocystivirus, uno de los cuatro géneros descritos en la familia Iridoviridae.
Los peces afectados por esta enfermedad presentan pequeños nódulos de color blanquecino, localizados preferentemente en la superficie del cuerpo y aletas. Se trata de una infección crónica auto-limitada, que suele ocasionar brotes sucesivos en una misma población.
La detección del virus in situ es una herramienta útil para estudios de patogénesis, pero también puede constituir una importante técnica de diagnóstico. El objetivo del presente trabajo ha sido el desarrollo y evaluación de técnicas in situ que permitan la detección específica del LCDV en cultivos celulares inoculados utilizando la línea SAF-1 (Bejar et al., 1997). Se han estudiado dos métodos inmunológicos: inmunofluorescencia indirecta (IFI) e inmunohistoquímica (IHQ), utilizando un suero policlonal frente a una proteína estructural del virión de 60,1 kDa. Paralelamente se evaluó la técnica de hibridación in situ (HIS) utilizando como sonda un fragmento de 270 pb del gen que codifica la proteína mayoritaria de la cápside. El marcaje de la sonda se realizó mediante PCR usando nucleótidos marcados con digoxigenina.
Se optimizaron parámetros que pueden influir en las técnicas ensayadas, tales como el tipo de permeabilización y fijación, o las condiciones de hibridación. De los protocolos ensayados para la fijación y permeabilización de las células, el que proporcionó mejores resultados para las técnicas inmunológicas fue el que utiliza el fijador (formalina neutra tamponada) junto con el permeabilizante (Tritón X-100 al 0,3%); en cambio para la HIS el mejor resultado se obtuvo al incrementar la concentración del permeabilizante hasta el 3% durante 30 min una vez eliminado el fijador.
Estas técnicas han permitido la detección de antígenos víricos (IFI e IHQ) y genoma viral (HIS) en células SAF-1 inoculadas con aislados de LCDV procedentes de distintas especies de peces. Todos los aislados fueron reconocidos con la misma intensidad por los anticuerpos o la sonda. Las técnicas de HIS e IHQ presentan similar sensibilidad, haciendo posible la detección del virus en cultivos celulares inoculados con 103 TCID50/ml. La técnica de IFI presentó una mayor sensibilidad, siendo posible la detección del virus en cultivos de células SAF-1 inoculadas con tan solo 101 TCID50/ml. En todos los casos las células fueron procesadas a los 5 días post-inoculación.
Bejar J, Borrego JJ & Alvarez MC. 1997. A continuous cell line from the cultured marine fish gilt-head sea bream (Sparus aurata, L.) Aquaculture, 150: 143-153.