Tricotecenos de tipo B y hongos productores en cereales

 

Misericordia Jiménez^a, Francisco M. Valle-Algarra^b, Ángel Medina^a, Amparo Llorens^a , José V. Gimeno-Adelantad^ob, Rufino Mateo^b

^aDep. de Microbiología y Ecología, Facultad de Biología, Universitat de València, Spain. b Dep.  de Química Analítica, Facultad de Química, Universitat de València. Dr. Moliner 50, E-46100 Burjasot, Valencia.

 

En la actualidad existen discrepancias entre los distintos autores en relación con las especies de Fusarium implicadas en la producción de tricotecenos B, identidad de los tricotecenos que produce cada quimiotipo y distribución geográfica de los mismos. Por ello, el presente estudio se centró en tres objetivos:

1. Caracterización morfológica, genética y fisiológica de aislamientos de Fusarium spp. obtenidos de cereales y otros huéspedes cultivados en España. Para ello, se estudiaron sus características macroscópicas y microscópicas, se realizaron análisis de restricción de la región IGS del gen del rRNA (rDNA) con seis enzimas, con lo que se valoró la utilidad de este método con fines taxonómicos y se establecieron sus perfiles de producción de tricotecenos B, concretamente de nivalenol (NIV), desoxinivalenol (DON), 3-acetildesoxinivalenol (3AcDON) y 15-acetildesoxinivalenol (15AcDON). Adicionalmente, también se estudió la capacidad de estos aislamientos para producir zearalenona (ZEA), ya que esta toxina fue detectada en los cultivos junto con los tricotecenos B. Para evitar identificaciones erróneas, tras el análisis de tricotecenos B mediante cromatografía de gases con detector de captura de electrones (GC-ECD) su identidad fue confirmada mediante espectrometría de masas (GC-MS). La determinación de ZEA fue realizada mediante cromatografía de líquidos con detectores de fluorescencia (LC-FLD) y de red de diodos (LC-DAD). En este caso, la confirmación se realizó mediante espectrometría de masas con trampa de iones (LC-MS/MS).

2. Estudio ecofisiológico de los aislamientos de F. graminearum y F. culmorum productores de tricotecenos B y ZEA seleccionados previamente, el cual fue llevado a cabo mediante cultivos in vitro en cereales a diferentes temperaturas de incubación (15, 20, 28 y 32 ºC) y con distintas actividades acuosas (a_w) (0.96, 0.97 y 0.98). Ello permitió la realización de un análisis multifactorial de los datos obtenidos.

3. Estudio crítico y optimización de la metodología analítica para la determinación de tricotecenos B y ZEA en cereales y cultivos fúngicos. Con tal fin y dependiendo de las toxinas, se ensayaron diferentes métodos de extracción y purificación en fase líquida y en fase sólida (SPE) con columnas de inmunoafinidad, MycoSep 225, florisil, silica y columnas diseñadas en nuestro laboratorio preparadas con mezclas de alúmina, Celite 545, C₁₈, sílica y carbón activo en diferentes proporciones. Para el análisis de los tricotecenos mediante LC-FLD se prepararon derivados fluorescentes con cloruro de cumarina 3-carbonilo y para su análisis mediante GC-ECD se prepararon derivados volátiles perfluorados con los anhídridos pentafluoropropiónico o heptafluorobutírico. Para el análisis cromatográfico se emplearon diferentes columnas: C₁₈ en LC y columnas capilares con polisiloxanos de diferente polaridad (HP-1701 y HP-5) en GC.

            Los resultados indicaron que la mayor parte de los aislamientos de F. graminearum y F. culmorum y el aislamiento de F. cerealis incluidos en este trabajo son del quimiotipo NIV aunque algunos producen pequeñas cantidades de DON, lo que les confiere unas características muy particulares. Ningún aislamiento de F. oxysporum y Gibberella fujikuroi fue productor de tricotecenos B. Los patrones de restricción de la región IGS obtenidos, no mostraron ninguna relación con el huésped u origen geográfico de los aislamientos, aunque hay que considerar que todos fueron cultivados en España. Sin embargo, los haplotipos obtenidos con los seis enzimas de restricción empleados permitieron la separación a nivel interespecífico de las especie de Fusarium estudiadas y a nivel intraespecífico en F. oxysporum, por lo que éste puede ser un método rápido y de fácil aplicación con fines taxonómicos en este complejo género.

            En relación con la influencia de la cepa, a_w y temperatura en la producción de tricotecenos B y ZEA, los resultados indicaron que dentro del rango de a_w ensayadas no se detectan diferencias significativas en el nivel de producción de las toxinas. Sin embargo, tanto la temperatura como el aislamiento si afectaron significativamente a los niveles de toxinas encontrados en los cultivos. Las temperaturas óptimas para la máxima producción de DON, NIV, 3AcDON y ZEA en cereales fueron 28, 20, 15 y 20 ºC, respectivamente. Ningún aislamiento fue productor de 15 AcDON.

            La metodología propuesta para el análisis de tricotecenos B en cereales consistiría en el empleo de columnas comerciales MycoSep 225 o columnas con rellenos formados por mezclas de alúmina-carbón activo-sílice o alúmina-carbón activo-C₁₈ diseñadas en nuestro laboratorio que proporcionaron resultados similares  con un coste muy inferior. Los pentafluoropropionil derivados fueron más estables que los heptafluorobutiril derivados obteniéndose con ambos recuperaciones muy similares. La columna HP-1701 permitió separar DON, NIV, 3AcDON y 15AcDON, mientras que con la columna HP-5 no se consiguió separar los dos últimos. Por tanto, la elección de la columna es importante para una correcta evaluación de los derivados acetilados del DON en muestras y para realizar identificaciones adecuadas de los diferentes quimiotipos. Empleando la metodología propuesta, hasta el momento hemos estudiado la incidencia de DON en muestras de trigo y harina de trigo comercializadas en España y destinadas a consumo humano. Los resultados obtenidos indicaron que el 21% de las muestras de trigo y 8% de las muestras de harina de trigo  contienen DON.