Coproducción de nisina y lacticina 481 por nuevos aislados de Lactococcus lactis

Bravo, D. y Medina, M.

Dpto. Tecnología de Alimentos, INIA, Ctra. de La Coruña km 7, 28040 Madrid dbravo@inia.es

La producción de bacteriocinas es una de las características deseables en la búsqueda de bacterias lácticas de interés para la industria alimentaria. Las bacteriocinas, aplicadas individualmente o en combinación con otros antimicrobianos, representan una de las estrategias de mayor interés en seguridad microbiológica de alimentos.

Se ha investigado la producción de bacteriocinas de 13 aislados obtenidos de leche cruda de oveja procedente de la zona de producción de queso Zamorano DO. Las muestras de leche se transformaron en cuajadas y se sembraron en placas de agar MRS-b-glicerofosfato inoculadas con Lactobacillus buchneri ST2A como indicador.

Los 13 aislados con actividad antimicrobiana se identificaron como Lactococcus lactis. Mediante la amplificación de los genes estructurales de bacteriocinas conocidas de Lactococcus se comprobó la presencia de los determinantes de nisina en 10 aislados y de lacticina 481 en los 13 aislados.

Utilizando electroforesis en campos pulsados (PFGE) con SmaI y ApaI para las digestiones, se establecieron 4 pulsotipos distintos: I (aislado Za-11), II (aislados Za-105 y Za-113), III (aislados Za-103 y Za-106) y IV (aislados Za-101, Za-102, Za-108, Za-109, Za-110, Za-111, Za-112 y Za-114).

El sobrenadante de los cultivos en M17, MRS y leche se aplicó en placas de agar MRS-b-glicerofosfato con L. buchneri ST2A (sensible a nisina y resistente a lacticina 481) y L. lactis subsp. cremoris HP (sensible a las dos bacteriocinas). Se comprobó la producción de lacticina 481 en los aislados de los pulsotipos I y II y la coproducción de las dos bacteriocinas en los aislados de los pulsotipos de III y IV.

Los genes precursores de las actividades tipo nisina y tipo lacticina 481 del aislado Za-108 fueron secuenciados y comparados con la secuencia original de nisina Z y lacticina 481. La secuencia del precursor de actividad tipo lacticina del aislado Za-108 presentó una identidad del 100% con la secuencia de la lacticina 481 y la secuencia de la actividad tipo nisina un 96% de identidad con la nisina Z. Tan solo se observaron dos cambios polimórficos (N₁₇ por D₁₇ y V₃₉ por L₃₉).

Las dos bacteriocinas producidas por un mismo aislado se separaron mediante SDS-PAGE. La actividad antimicrobiana se detectó en el gel con sobrecapa de agar inoculado con los respectivos indicadores. Las actividades también se separaron con columnas C₁₈ Sep-Pak. La actividad nisina se recuperó eluyendo con metanol al 10% y la lacticina 481 con metanol al 75%.