Desarrollo de un sistema de PCR a tiempo real para la detección y cuantificación de Staphylococcus aureus en alimentos.

Elizaquível, P.¹, Martinez-Blanch, J.F. ², Alarcón, B.^1,2, Viñedo, B.^1,2 y Aznar, R. ^1,2*

¹Departamento de Microbiología y Ecología, Universitat de València. ²Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, CSIC. *rosa.aznar@uv.es

Staphylococcus aureus es la especie más comúnmente asociada a la intoxicación alimentaria estafilocócica, una de las toxiinfecciones transmitidas por alimentos con mayor repercusión económica a nivel mundial. Habitualmente su detección en alimentos se realiza por técnicas culturales basadas en el uso de medios selectivos y la posterior identificación mediante pruebas bioquímicas. Dichas técnicas consumen mucho tiempo y en ocasiones llevan a identificaciones erróneas. Como alternativa, las técnicas moleculares basadas en la PCR tienen como ventaja una mayor rapidez y seguridad en la identificación e incluso la PCR a tiempo real (RTi-PCR), permite la detección y cuantificación automatizada, con una mayor sensibilidad y rapidez. La RTi-PCR se basa en la detección de una señal fluorescente emitida bien por un fluoróforo que se une al ADN de doble cadena (SYBR Green I), bien mediante sondas marcadas que hibridan en el amplificado y emiten fluorescencia al ser separadas debido a la actividad 5’ nucleasa de la polimerasa. La monitorización de la reacción, permite determinar el ciclo en el cual se inicia la fase exponencial de la amplificación (ciclo umbral, Ct), parámetro que permite la cuantificación.

En este trabajo se ha puesto a punto un sistema de RTi-PCR para la detección y cuantificación de S. aureus. Mediante el programa informático Primer Express^TM versión 1.0 (Applied Biosystems), y utilizando como diana el gen de la nucleasa termoestable (nuc), se diseñaron cebadores específicos para su utilización con SYBR Green I, y una sonda TaqMan para ensayos de tipo 5’ nucleasa. Se ajustaron las condiciones de reacción con ambos sistemas y se comprobó la especificidad de los cebadores y la sonda en 36 cepas de referencia (11 de la especie S. aureus, 15 de otras especies del género, 10 de otros géneros) y 56 aislados de S. aureus procedentes de distintos alimentos. Se establecieron las curvas patrón para cuantificación, a partir de diluciones decimales seriadas de DNA purificado y de suspensiones celulares calibradas de la cepa S. aureus CECT 86^T. Los resultados obtenidos en cuanto a sensibilidad fueron de 1 célula por reacción, con SYBR Green I y de 10 células con TaqMan, utilizando cultivos puros. En ensayos con ternera inoculada artificialmente, y mediante la extracción de DNA total con el sistema DNeasy Tissue Kit (Qiagen), los límites de detección obtenidos fueron de 10² células/g con SYBR Green I y de 10³ células/g con TaqMan.

El procedimiento de RTi-PCR con SYBR Green I desarrollado permite la detección específica, rápida y cuantitativa de S. aureus, con un nivel de sensibilidad adecuado para su aplicación en alimentos y, con la ventaja adicional de un coste menor respecto al sistema TaqMan, dado que no requiere de la sonda.