Detección de Listeria monocytogenes en carne de pollo mediante PCR a tiempo real: comparación de muestras artificiales y naturales

Navas Fernández J., Monks Jantzen M., Ortiz Jareño S. , López Abarquero P. y Martínez Suárez J.V.

Tecnología de Alimentos, INIA, Ctra. de La Coruña km 7’5, 28010 Madrid. Correspondencia: jaimenf@inia.es

El objetivo de este trabajo fue diseñar un método sencillo, rápido y barato de PCR para detectar de forma específica y cuantitativa el patógeno alimentario Listeria monocytogenes en carne cruda de pollo.

El método se basa en la concentración de las células bacterianas por centrifugación, la purificación del DNA con la resina Chelex-100 y su amplificación mediante PCR a tiempo real, utilizando como diana el gen inlA exclusivo de L. monocytogenes e implicado en su virulencia. Los productos de PCR se detectan con SYBR Green en un equipo Mx3000P.

Muestras artificiales

Inicialmente, se comprobó que con cultivos puros la respuesta del ensayo era lineal para 5 unidades logarítmicas. En carne cruda y picada de pollo, obtenida comercialmente y contaminada artificialmente con diluciones decimales de un cultivo del patógeno, el método reproducía la misma respuesta, desde 10² a 10⁶ UFC de L. monocytogenes por g de carne. Antes del enriquecimiento, por tanto, el límite de detección era 10² UFC/g y el de cuantificación 10³ UFC/g. El tiempo necesario para llevar a cabo el ensayo fue inferior a 6 h. Tras 24 h de enriquecimiento el ensayo permitía detectar menos de 1 UFC de L. monocytogenes por g de carne, y el tiempo total necesario para completar el ensayo fue inferior a 30 h.

Muestras naturales

Con muestras de carne cruda y picada de pollo obtenida comercialmente y contaminada de forma natural con L. monocytogenes, se comprobó que el grado de contaminación era bajo (menos de 10 NMP/g) y que se precisaba un enriquecimiento de 24 h en medio selectivo para obtener un resultado positivo por PCR. El resultado negativo de la PCR de algunas muestras con cultivo positivo no se debía, aparentemente, a la presencia de inhibidores sino al abundante crecimiento de flora bacteriana en el enriquecimiento selectivo: si los niveles de L. monocytogenes tras 24 h no superaban 10⁴ UFC/mL (debido a la flora bacteriana de la carne, incluídas otras especies de Listeria), el resultado podía ser negativo.

A pesar del resultado favorable obtenido con las muestras artificiales, los niveles de la contaminación natural estaban por debajo del límite de detección por PCR y se necesitó siempre realizar un enriquecimiento.

Trabajo financiado por los proyectos RTA02-034 y PTR1995-0789-OP, y becas del INIA (JNF) y del CNPq de Brasil (MMJ).