Regulación de la ruta de degradación del ácido 3-hidroxifenilpropiónico en Escherichia coli.

Manso, I.¹, Galán, B.¹, Sanz, J. M. ², Prieto, M. A.¹ y García, J. L.¹

¹Departamento de Microbiología Molecular. Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)-CSIC, C/ Ramiro de Maeztu, 9, 28040 Madrid. ²Instituto de Biología Molecular y Celular. Universidad Miguel Hernández. Avda. Ferrocarril s/n., 03202-Elche (Alicante). macoi@cib.csic.es

El ácido 3-hidroxifenilpropiónico (3HPP) es un compuesto ampliamente distribuido en la naturaleza procedente de la degradación de la lignina y de otros compuestos aromáticos sintetizados por las plantas. Este compuesto sirve de fuente de carbono y energía a distintas bacterias. La ruta de degradación del 3HPP en Escherichia coli está codificada por el cluster mhp localizado en el minuto 8 del cromosoma. El cluster mhp contiene un operón catabólico (mhpABCDFE), un gen transportador (mhpT), y un gen regulador (mhpR) que se transcribe en sentido opuesto al resto de los genes. El regulador MhpR es un activador transcripcional que pertenece a la familia de reguladores IclR y que controla la expresión de los genes catabólicos mhp mediada por el promotor Pa. La proteína MhpR detecta los niveles de 3HPP para activar la transcripción. La expresión de los genes mhp está sujeta a una represión catabólica por glucosa mediada por la proteína CRP.

Para caracterizar MhpR se ha hiperexpresado esta proteína en E. coli fusionada a un tag de 6His en el extremo N-terminal, lo que ha permitido purificarla en un sólo paso a homogeneidad electroforética.

Se ha demostrado mediante ensayos de retardo en gel que MhpR se une al promotor Pa en presencia y ausencia del inductor 3HPP, aumentando la afinidad de la proteína por el DNA en presencia de 3HPP. Mediante ultracentrifugación analítica se ha determinado que la proteína MhpR es un dímero en solución. Por otro lado, se ha modelado una estructura tridimensional en la cual se describe un dominio de unión al DNA de tipo hélice-giro-hélice alado y un dominio de activación de unión al inductor 3HPP. Finalmente, mediante error-prone PCR hemos obtenido una colección de mutantes de MhpR cuya actividad está alterada positiva y negativamente, lo que permitirá conocer los aminoácidos implicados en el mecanismo de acción de este regulador.