Aislamiento y clonación del gen de la quimosina de Bubalis arnee bubalis en E. coli.

Vallejo, J.A.; Ageitos, J.M.; Veiga-Crespo; Poza, M. y Villa, T.G.

Departamento de Microbiología, Universidad de Santiago de Compostela C.P. 15706 Santiago de Compostela jvallejo@usc.es.

Las proteasas aspárticas actúan sobre la k-caseína de la leche originando la desestabilización de las micelas y dando lugar a la coagulación de la leche, efecto que es empleado para la elaboración de masas queseras. En la actualidad existen cuatro fuentes de producción de cuajo destinadas a la elaboración de masas queseras: las reninas animales (quimosinas), extraídas a partir del prensado directo de cuajares de terneros lechales; las proteasas aspárticas microbianas, obtenidas a partir del cultivo de microorganismos tales como Rhizomucor miehei; las proteasas vegetales, como la cardosina obtenida mediante infusiones de Cynara cardunculus y las recombinantes, construidas mediante ingeniería genética. En general, la incapacidad de las proteasas animales o vegetales de cubrir las demandas actuales del mercado, ha conducido a un aumento del interés por las proteasas microbianas o por las recombinantes. La introducción en el mercado de una cepa de E. coli que contiene el gen de la quimosina bovina representó el primer eslabón de una cadena que pretende reemplazar paulatinamente el cuajo animal por el microbiano o por el obtenido mediante ingeniería genética. El búfalo (Bubalus arnee bubalis) lechal produce una quimosina similar a la quimosina bovina que es capaz de originar masas queseras de gran calidad cuando se emplea como sustrato leche de vaca o de búfala. Además, el gen que codifica esta quimosina guarda un alto grado de similitud con el gen de la quimosina bovina, proteasa aspártica elegida en la industria quesera como la mejor para la fabricación de queso. Teniendo en cuenta que las granjas de búfalas están prosperando en la actualidad, se planteó en este trabajo el aislamiento y la clonación del gen de la quimosina de Bubalus arnee bubalis en E. coli como paso previo para su futura sobreexpresión en levaduras. El gen de la quimosina de búfalo se aisló en forma de cDNA, mediante la realización de RT-PCR empleando como molde RNAm extraído a partir de tejido de cuajar de un búfalo lechal. Las parejas de oligonucleótidos empleados se diseñaron a partir de una secuencia del gen de la quimosina bovina y a partir una secuencia de un gen de la quimosina de búfalo, ambas encontradas en las bases de genes (Genbank). La amplificación funcionó únicamente cuando se emplearon los oligonucleótidos de origen bovino, ya que la secuencia de la quimosina de búfalo descrita en las bases de genes resultó estar incompleta en uno de sus extremos. El cDNA obtenido presentó un 97% de homología con el gen de la quimosina bovina. Esta secuencia de cDNA se insertó en el vector PCR Blunt II TOPO (Invitrogen) empleando el Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen). La construcción obtenida se analizó y se empleó para transformar células de E. coli TOP10. Las colonias recombinantes se seleccionaron en placas de LB con kanamicina y se analizaron con el fin de confirmar la presencia de inserto. Finalmente, se obtuvo una batería de colonias de E. coli portadoras del gen de la quimosina de Bubalus arnee bubalis.