Las micotoxinas son extraídas de la muestra con una mezcla de acetonitrilo y soluciones acuosas de cloruro potasico al 4 % y ácido glicolico al 10% (180 + 10 + 10), una parte alicuota del extracto es filtrada y purificada con diferentes solventes y cambios de pH. El extracto limpio es evaporado y redisuelto en cloroformo. La separación de las micotoxinas es llevada a cabo por medio de la cromatografía en capa fina con distintos solventes de desarrollo y la identificación y confirmación se realiza con variadas reacciones químicas , algunas de ellas especificas.

La cuantificación de las micotoxinas se realiza por el método del limite inferior de comprobación.

Las recuperaciones para las diferentes micotoxinas son de: Aflatoxinas, 95-98%. Ocratoxinas, 95-97%. Citrinina, 91-98%. Zearalenona, 92-96%. Sterigmatocistina, 95-97%. Toxina T-2, 90-93%. Diacetoxyscirpenol, 85-88%. Patulina, 90-93%. Acido penicilico, 72-76%. Penitrems A y B, 90-97%.

Las concentraciones mínimas detectables (microgramos/Kg) son: Aflatoxinas = 2,5. Ocratoxina A y Etil éster A = 50. Ocratoxina B y Etil éster B = 65. Citrinina = 6. Zearalenona = 80. Sterigmatocistina = 72. Toxina T-2 = 280. Diacetoxyscirpenol = 700. Patulina = 150. Acido penicilico = 700. Penitrem A = 5500. Penitrem B = 6700.

1.- APARATOS

1.1.- Balanza y microbalanza con precisiones de 1 y 0,0001 mg, respectivamente.

1.2.- Molino de cuchillas o equivalente.

1.3.- Erlenmeyers vidrio ámbar de 250 ml, con esmerilado 29/32 y tapón de material plástico resistente a los líquidos orgánicos.

1.4.- Agitador de vaivén o de muñeca, adaptable a los erlenmeyers de 250 ml.

1.5.- Papel de filtro Macherey-Nagel MN 640w de 9 cm de diámetro (filtración rápida) o equivalente.

1.6.- Embudos de filtración cuello corto, de 50 mm de diámetro interior.

1.7.- Pipeta de bulbo de 50 ml.

1.8.- Embudo de decantación cónico (vidrio ámbar claro), de 150-200 ml de capacidad con esmerilado 14/23, tapón de material plástico resistente a los líquidos orgánicos y llave de teflón.

1.9.- Jeringa hipodérmica de 50 ml de capacidad, la aguja de la jeringa consistirá en un tubo de teflón de 80-90 mm de longitud y 2 mm de diámetro interior.

1.10.- Tubo de vidrio ámbar en forma de pera de 250-300 ml de capacidad, uno de los extremos tendrá 20 mm cm de largo y 10 mm de diámetro interior. Esta sección estrecha estará graduada con la máxima precisión posible y tendrá unos 2 ml de capacidad con divisiones de 1/10. El otro extremo del tubo tendrá un esmerilado 29/32 adaptable a rotavapor y a tapón de vidrio o material plástico resistente a líquidos orgánicos. El tubo resistirá el vacío

1.11.- Rotavapor con baño María regulable entre 20 -100ºC.

1.12.- Bola Kjeldhal sin el tubo estrecho interior, adaptable al rotavapor y al tubo 1.10.

1.13- Bomba de vacío, de membrana y válvulas de teflón, la bomba llevara incorporado un medidor de vacío que permitirá regular una depresión entre 0-0,95 Kg/cm2.

1.14.- Divisor de cromatoplacas con 20 púas rayadoras (o sistema equivalente) que permitirá dividir una cromatoplaca de 200 mm de anchura, en 20 franjas de 10 mm de ancho cada una, aproximadamente.

1.15.- Bastidores de cromatoplacas.

1.16.- Estufa de desecación, regulable entre 20-200ºC.

1.17.- Desecador de vidrio y armarios desecadores con silica gel con indicador, como agente desecante.

1.18.- Miniviales de 1 y 5 ml de capacidad, vidrio ámbar, tapón de rosca y obturación de teflón.

1.19.- Tubos de vidrio ámbar de 7 ml de capacidad, tapón de rosca y obturación de teflón.

1.20.- Microgeringas de 50 microlitros Hamilton nº 1705 punto estilo 3 (la punta del embolo será de teflón), o equivalente.

1.21.- Dispensador repetitivo Hamilton PB 600-1 adaptable a las microgeringas anteriores, o equivalente.

1.22.- Secador de cabello.

1.23.- Campana de extracción de gases.

1.24.- Cámaras de separación cromatografica de 210 x 88 x 210 mm con esmerilado y tapa botón, la cámara tendrá ranuras para la inserción de cromatoplacas de 200 x 200 mm, Desaga nº 120167, o equivalente.

1.25.- Pulverizador de reactivos con cámara de gas intercambiable o sistema equivalente.

1.26.- Cámara de pulverización de reactivos.

1.27.- Lampara Ultravioleta con filtro azul-violeta UG-5, Schott, Germany, o equivalente, a través del filtro pasará la luz ultravioleta de 366 y 254 nm (lampara ultravioleta Camag standard 29200 o 29230, o equivalente). Colocar las cromatoplacas a 100 mm de distancia de la lampara y efectuar todas las observaciones en sala completamente oscura. Proteger los ojos con un filtro amarillo GG-4,Schott, Germany, o equivalente).

1.28.- Agitador de tubos.

1.29.- Sistema de iluminación con luz visible por reflexión y trasparencia (con fluorescentes tipo "Osram -L" BW 25, o equivalentes).

1.30.- Placas para cromatografia en capa fina, placas de vidrio de 200 x 200 mm, pre-preparadas con 0,25 mm de espesor de capa (Sil G-25HR, Macherey-Nagel and Co., Duren, West Germany, nº 809033, o equivalente). Con un divisor de cromatoplacas, dividir estas en 20 franjas de 1 cm de anchura cada una. Activar las cromatoplacas, calentando a 110ºC durante 30 minutos. Guardar las placas en desecador de vidrio hasta el momento de su uso. Emplear las cromatoplacas a temperatura ambiente.

1.31.- Placas para cromatografia en capa fina impregnadas en ácido glicolico (solo para el análisis de la citrinina), utilizar las cromatoplacas anteriores 1.30 ya divididas pero sin activar , e impregnarlas con ácido glicolico a base de sumergirlas en una solución de ácido glicolico al 10% en etanol durante 1-2 minutos. Mantener 3-5 minutos en posición vertical para drenar el exceso de solvente. Limpiar los residuos de ácido glicolico que quedan en la parte de vidrio trasera de la cromatoplaca con toallita suave de papel. Dejar secar a temperatura ambiente durante 1 hora en posición horizontal y en campana de gases. Después calentar las cromatoplacas durante 20 minutos a 65ºC (3).

Guardar las placas en desecador de vidrio hasta el momento de su uso. Emplear las cromatoplacas a temperatura ambiente. (como alternativa, se pueden dejar secar las cromatoplacas a temperatura ambiente durante 2 horas y omitir el calentamiento a 65ºC) (3).





2.- REACTIVOS (emplearlos grado análitico)

2.1.- Solución de cloruro potasico; 4% p/v en agua destilada

2.2.- Soluciones de ácido glicolico; 10% p/v en agua y 10% p/v en etanol absoluto.

2.3.- Solución de cloruro de aluminio; disolver 20 g de AlCl3.6H2O en 100 ml de etanol.

2.4.- Solución de bicarbonato de sodio; disolver 6 g de NaHCO3 en 100 ml de agua y añadir 20 ml de etanol.

2.5.- Solución de 3-Metil-2-Benzotiazolinona hidrazona hidroclorhidrica monohidrato (MBTH) ; disolver 0,5 g de MBTH.HCl.H20 en 100 ml de agua destilada, guardar en refrigerador, preparar la solución fresca cada 3 dias.

2.6.- Solución de p-anisaldehido (4-metoxibenzaldehido); disolver 0,5 ml de p-anisaldehido en una solución de, metanol + ácido acetico glacial + ácido sulfurico 98% (85 + 10 + 5), preparar en el momento en que vaya a usarse.

2.7.- Solución de cloruro ferrico; disolver 1 g de FeCl3 anhidro en 100 ml de 1-butanol.

2.8.- Soluciones de ácido sulfurico: a.- H2SO4 + agua (1+3), b.- H2SO4 + metanol (1+4), c.- H2SO4 50%.

2.9.- Solución de ácido trifluoroacetico; diluir ácido trifluoroacetico con benzeno o cloroformo en la proporción (1+1) . Preparar la solución fresca diariamente. (precaución: benceno y cloroformo son posibles carcinogeneticos).

2.10.- Solución buffer pH 9,0; mezclar 50 ml de una solución de borato de sodio 0,025 M y 4,6 ml de una solucion de ácido clorhidrico 0,1 M.

2.11.- Solución de Fast Violet B salt; disolver 0,7 g de Fast Violet B salt (SIGMA F4377 o 1631, o equivalente) en 100 ml de agua destilada. Guardar en refrigerador por un máximo de 5 dias.

2.12.- Gas nitrogeno puro.

2.13.- Acetonitrilo.

2.14.- Isooctano.

2.15.- Solución de ácido clorhidrico 1 N.

2.16.- Cloroformo.

2.17.- Eter etilico anhidro.

2.18.- Acido glicolico.

2.19.- Sulfato sodico anhidro.

2.20.- Patrones de micotoxinas; utilizar micotoxinas grado patrón de referencia, SIGMA CHEMICAL Co., o equivalentes.

Guardar al abrigo de la luz y a 4ºC. Comprobar la pureza de los patrones como en (13,14 ) y por sus propiedades espectrofotometricas (15-17).

2.21.- Soluciones patrón de micotoxinas; para preparar las soluciones, emplear cloroformo grado reactivo análisis. Mantener las soluciones en viales cubiertos con papel de aluminio o en tubos de vidrio color ambar, ambos con tapon de rosca e obturación de teflón. Guardar a 4ºC. Las soluciones estaran a temperatura ambiente en el momento en que vayan a ser utilizadas.

2.21.1.- Aflatoxinas B1, B2, G1 y G2; preparar por separado soluciones de cada micotoxina en concentración de 10 microgramos/ml de cloroformo, combinar volumenes de cada solución para preparar una solución conjunta de trabajo que contendrá: 3 microgramos AB1; 0,8 microgramos AB2; 3 microgramos AG1 y 0,8 microgramos AG2/ml de cloroformo.

2.21.2.- Ocratoxinas A, B, etil éster A y etil éster B; preparar por separado soluciones de cada micotoxina en concentración de 80 microgramos/ml de cloroformo, combinar volumenes de cada solución para preparar una solución conjunta de trabajo que contendra 20 microgramos de cada ocratoxina y su correspondiente etil éster/ml de cloroformo.

2.21.3.- Otras micotoxinas (en microgramos/ml); citrinina = 25, zearalenona = 65, sterigmatocistina = 20, patulina = 65, toxina T-2 = 100, diacetoxyscirpenol = 500, ácido penicilico = 300, penitrem A = 1000, penitrem B = 1000.

2.22.- Solventes de desarrollo para la cromatografia en capa fina; prepararlos en el momento en que vayan a ser usados.

1.- Tolueno-etil acetato-cloroformo-ácido formico 90% (70+50+50+20) (1,2,8)

2.- Cloroformo-éter etilico-ácido acetico (170+30+10) (18)

3.- Cloroformo-acetona (176+24) (1,2,8)

4.- Benzeno-cloroformo-acetona (90+80+30) (19)

5.- Cloroformo-acetona (180+20) (20)

6.- Cloroformo-acetona (186+14) (18)

7.- Tolueno-cloroformo-acetona (30+150+20) (1,2,8)

8.- Cloroformo-acetona-2 propanol (165+30+5) (21)

9.- Tolueno-etil acetato-cloroformo (100+50+50) (18)

10.- Eter etilico-ciclohexano-etil acetato-ácido formico 90% (150+40+10+4) (1,2,8)

11.- Hexano-acetona-acido acetico (180+20+10) (22)

12.- Benzeno-ácido acetico (180+20) (20)

13.- Eter etilico-ciclohexano-etil acetato-ácido acetico (150+40+10+4) (1,2,8)

14.- Tolueno-etil acetato-cloroformo-ácido formico 90% (80+50+60+10) (1,2,8)

15.- Tolueno-etil acetato-ácido formico 90% (100+90+10) (1,2,8)

16.- Benzeno-metanol-ácido acetico (180+10+10) (22)

17.- Etil acetato-acetona-agua (80+80+32) (23)

18.- Eter etilico-ciclohexano-ácido formico 90% (150+50+2) (1,2,8)

19.- Eter etilico-metanol-agua-ácido formico 90% (190+8+2+2) (24)

20.- Tolueno-etil acetato (50+150) (18)

21.- Etil acetato-cloroformo-ácido formico 90% (120+80+2) (25)

22.- Cloroformo-etil acetato (100+100) (25)

23.- Cloroformo-metanol (190+10) (1,2,8)

24.- Cloroformo-etanol (170+30) (1,2,8)

25.- Eter etilico-ciclohexano (150+50) (18)

26.- Cloroformo-metanol (194+6) (25)

27.- Cloroformo-etanol (180+20) (25)

28.- Tolueno-etanol (100+100) (18)

29.- Cloroformo-metanol-acetona (65+65+65) (18)

30.- Tolueno-etil acetato-cloroformo-ácido formico 90% (100+50+50+0,5) (2,26)

31.- Tolueno-cloroformo-acetona-ácido formico 90% (30+150+20+0,5) (2,26)

32.- Tolueno-etil acetato-ácido formico 90% (120+60+20) (1)

33.- Tolueno-eter etilico-ciclohexano-ácido formico 90% (10+140+50+2) (4)

34.- Eter etilico-ciclohexano-etil acetato-ácido formico 90% (150+50+10+10) (1,8)

35.- Tolueno-etil acetato-cloroformo-ácido formico 90% (80+50+69+6) (2)

36.- Tolueno-etil acetato-cloroformo-ácido formico 90% (90+45+50+5) (2)

37.- Tolueno-etil acetato-cloroformo-ácido formico 90% (70+55+55+10) (2)

38.- Tolueno-cloroformo-acetona-ácido formico 90% (30+150+20+4) (2)

39.- Cloroformo-acetona-ciclohexano (100+10+90) (2)

40.- Tolueno-cloroformo-etil acetato (25+145+30) (2)

41.- Tolueno-cloroformo (52+148) (2)

42.- Tolueno-cloroformo (10+190) (2)

43.- Eter etilico-hexano-etil acetato-ácido formico 90% (70+90+40+2) (2)

44.- Eter etilico-hexano-etil acetato (50+100+50) (2)

45.- Cloroformo-metanol-hexano (128+2+70) (27)

46.- Tolueno-etil acetato-cloroformo (95+55+50) (28)

47.- Benzeno-cloroformo-acetona (85+85+30) (28)

48.- Tolueno-etil acetato-ácido formico 90% (100+95+5) (4)

49.- Eter etilico-hexano (120+80) (4)

3.- EXTRACCION Y LIMPIEZA (1, 3, 8, 12, 22)

3.1.- Moler la muestra de forma que pase a través de un tamiz de 0,8-1 mm de luz de malla.

3.2.- Pesar 30 g de muestra molida y homogeneizada y llevarlos a un erlenmeyer de 250 ml color ámbar. Añadir 90 ml de acetonitrilo, 5 ml de solución acuosa de cloruro potasico al 4% y 5 ml de solución acuosa de ácido glicolico al 10%. Tapar firmemente, agitar el erlenmeyer con moderación y abrir con cuidado, volver a tapar.

3.3.- Llevar al agitador y agitar vigorosamente durante 30 minutos.

3.4.- Filtrar el extracto a través del papel de filtro 1.5., cubrir el papel de filtro con vidrio de reloj durante la filtración.

3.5.- Tomar 50 ml de filtrado y llevarlos al embudo de decantación 1.8.

3.6.- Añadir 50 ml de isooctano y agitar vigorosamente en redondo 15-20 segundos. Dejar separar las capas. Eliminar la capa superior de isooctano, aspirando por medio de la jeringa hipodérmica 1.9., apurar al máximo y tener cuidado en no aspirar la capa inferior de acetonitrilo (no importa que quede una pequeña cantidad de isooctano).

3.7.- Delipidar nuevamente con 3 porciones más de 50 ml de isooctano cada una y eliminar la capa de isooctano como anteriormente.

3.8.- Añadir a la capa de acetonitrilo, 12,5 ml de agua destilada y agitar. Añadir después 25 ml de cloroformo y agitar 10-15 segundos. Dejar separar las capas.

3.9.- Filtrar la capa inferior de cloroformo-acetonitrilo a través de papel de filtro 1.5., previamente lleno hasta el borde de sulfato sodico anhidro, recoger el filtrado en el tubo de vidrio graduado forma de pera 1.10.

3.10.- Añadir a la capa acuosa que queda en el embudo separador 1 ml de ácido clorhídrico 1 N y agitar. Añadir 20 ml de cloroformo, agitar 15-20 segundos y dejar separar las capas.

3.11.- Filtrar la capa inferior cloroformica pasándola a través del mismo sulfato sodico anhidro anterior y reunir este filtrado con el que ya tenemos en el tubo de vidrio graduado forma de pera 1.10.

3.12.- Repetir la extracción en la capa acuosa con 3-4 porciones de 10 ml de cloroformo cada una, filtrar cada extracto como anteriormente y reunir los filtrados en el tubo 1.10.

3.13.- Lavar el sulfato sodico anhidro con dos porciones de 5 ml de cloroformo y reunir los lavados en el tubo de vidrio 1.10.

Nota: Es importante eliminar el agua por medio del sulfato sodico anhidro, si es preciso, utilizar mayor cantidad de sulfato sodico anhidro a base de filtrar en un papel de filtro de mayor diametro ( 11 cm en lugar de 9 cm)

3.14.- Proceder a evaporar la mezcla de extractos hasta casi sequedad (0,1 ml aproximadamente), en evaporador rotatorio a 50-55ºC con vacío (depresión = 0,6-0,8 Kp/cm2).

3.15.-Enfriar y lavar las paredes del tubo con 2 porciones de 1 ml de cloroformo, llevando el liquido a la parte estrecha graduada (cada vez que se rompe el vacío es aconsejable introducir nitrógeno gas).

3.16.- Evaporar nuevamente en las condiciones de vacío anteriores, hasta casi sequedad, enfriar y añadir cloroformo lavando las paredes de la parte estrecha, hasta la división 0,5 ml de la misma.

Nota: No se debe evaporar a sequedad ya que en el caso de la patulina, existe el peligro de descomposición de esta (14)

3.17.- Tapar y agitar vigorosamente en agitador de tubos.

3.18.- El volumen final de extracto para la cromatografia en capa fina será de 0,5 ml y llamaremos extracto solución A ( 0,5 ml de solución de cloroformo = 15 g de muestra extractada).

3.19.- Empleando la dilución a 0,5 ml, depositaremos en la cromatoplaca, 5 microlitros de extracto.

3.20.- Si se quiere, se puede llevar la dilución a 1 ml en lugar de 0,5 ml (1 ml de solución de cloroformo = 15 g de muestra extractada).

3.21.- Empleando la dilución a 1 ml, depositaremos en la cromatoplaca, 10 microlitros de extracto.

3.22.- Tanto en un caso como en otro, llevar los extractos a miniviales 1.18. o a tubos color ámbar 1.19. Si no se puede empezar la cromatografia, guardar en frigorífico a 4ºC, sin embargo se recomienda empezar la cromatografia en el mismo día.




5.- CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA.

5.1.- Proceder como en 1.30. y 1.31.

5.2.- Por medio de microgeringas 1.20. con dispensador repetitivo 1.21. y en una línea imaginaria situada a 4 cm de la base de la cromatoplaca, depositar (sin deteriorar la superficie de la placa) los siguientes spots a intervalos de 1 cm y cada uno en una franja a aproximadamente 0,5 cm de los lados de la misma (no utilizar las franjas extremas de la cromatoplaca): a.- Dos spots de 5 microlitros de extracto solución A (caso la dilución final sea a 0,5 ml) o bien dos spots de 10 microlitros de extracto solución A (caso la dilución final sea a 1 ml).

5.3.- En uno de los spots correspondiente a 5 microlitros o 10 microlitros, superponer adecuadamente 5 microlitros de la solución patrón o de cada una de las soluciones patrón de micotoxinas que van a separarse en esa cromatoplaca (patrón interno).

5.4.- En otro punto aparte de línea imaginaria, depositar 5 microlitros de la solución patrón de micotoxina o superponer 5 microlitros de cada una de las soluciones patrón de micotoxinas que van a separarse en esa cromatoplaca (patrón externo).

Nota: es aconsejable que una vez efectuada la deposición total, el diámetro de los spots no sea superior a 2-2,5 mm. Para ello se colocaran los volúmenes totales, en fracciones de volumen y se dejara secar cada fracción antes de colocar la siguiente (Las microgeringas y el dispensador repetitivo ayudan a una correcta deposición. Existen sistemas para multideposición. Se puede ayudar el secado con corriente de gas nitrogeno).

5.5.- Trazar en la cromatoplaca una línea transversal que indicara la altura hasta donde debe llegar el solvente de desarrollo. Dicha altura estará contada desde la línea de origen imaginaria donde están la muestra y los patrones depositados. La altura será en general de 11-12 cm, excepto para el solvente nº 11 que será de 16 cm. Para el análisis de citrinina en cromatoplacas impregnadas en ácido glicolico, la altura será de 10-11 cm.

5.6.- Colocar aproximadamente 200 ml de solvente de desarrollo en las cámaras de separación cromatografica 1.24., éste alcanzará en la cámara una altura de aproximadamente 1,4-1,5 cm.

5.7.- Tapar la cámara y dejar 5-10 minutos. Después, introducir la cromatoplaca en posición vertical (sumergida en el solvente unos 1,4 cm) de forma que la superficie del silica gel este a 3-5 cm de distancia de la pared frontal de la cámara.

5.8.- Tapar y desarrollar en atmósfera insaturada hasta que el frente de solvente alcance la altura indicada.

5.9.- Sacar la cromatoplaca o cromatoplacas y llevar a vitrina de gases oscura. Dejar secar al aire y forzar el secado final con una suave corriente de aire moderadamente caliente o con corriente de gas nitrógeno (Importante: en la placa no deben quedar restos de solvente orgánico ni se notará prácticamente olor a ácido acético o ácido fórmico). Ver en 7.3. para zearalenona.

5.10.- En cada una de las situaciones que se van a describir, efectuar las identificaciones pertinentes por comparación (mismo Rf y los diferentes revelados) de las manchas correspondientes al extracto solución A con las manchas en las que está el patrón interno ( de preferencia) y externo.




6.- SEPARACION, DETECCION E IDENTIFICACION

En las observaciones de las cromatoplacas a la luz ultravioleta, colocar estas a 10 cm de distancia de la lampara 1.27. A ser posible, efectuar las observaciones con el filtro amarillo mencionado en 1.27.

6.1.- AFLATOXINAS, OCRATOXINAS, ZEARALENONA Y STERIGMATOCISTINA.

Cromatoplaca 1.- El orden de aparición de menor a mayor Rf es: aflatoxinas G2, G1, B2, B1, ocratoxina B, ocratoxina A, ocratoxina etil éster B, zearalenona, sterigmatocistina, ocratoxina etil éster A.

6.1.1.- Desarrollar la cromatoplaca con el solvente nº 1 y observar bajo luz ultravioleta de 366 y 254 nm (1,20,22).

A 366 nm:
Aflatoxinas B1, B2; Ocratoxina A y Etil éster A	= mancha azul brillante fluorescente.
Aflatoxinas G2,G1	= mancha azul verde brillante fluoresc.
Ocratoxina B y Etil éster B	= mancha azul débil.
Zearalenona	= mancha azul muy débil.
Sterigmatocistina	= mancha rojo ladrillo (solo en concentraciones de 0,6 µg/mancha)
A 254 nm:
Ocratoxina A, B y sus Etil esteres	= mancha azul brillante fluorescente.
Zearalenona	= mancha azul brillante fluorescente.

6.1.2.- Cubrir la superficie de la cromatoplaca con una lámina de vidrio, excepto la zona correspondiente a las aflatoxinas.

6.1.3.-Pulverizar esa zona con la solución de ácido sulfurico+agua (1+3) y observar a la luz ultravioleta de 366nm (29).

Aflatoxinas G2, G1, B2, B1

= mancha amarillo brillante fluorescente.

6.1.4.- Cubrir la superficie de la cromatoplaca con lámina de vidrio, excepto la zona comprendida entre la zearalenona y la ocratoxina etil éster A (zona en la que está la sterigmatocistina).

6.1.5.- Pulverizar con la solución de cloruro de aluminio 2.3. y calentar 10 minutos a 105ºC ,enfriar en la oscuridad y observar a la luz ultravioleta de 366 y 254 nm (18,22,30).

Sterigmatocistina

= mancha amarillo brillante fluorescente.

6.1.6.- En la misma cromatoplaca, una segunda pulverización de la zona correspondiente a la sterigmatocistina, con la solución de cloruro de aluminio 2.3. (no calentar), mejora la visualización de esta micotoxina respecto al fondo de la cromatoplaca cuando observada de nuevo a la luz ultravioleta de 366 y 254 nm (1, 4, 6, 8, 10).

6.1.7.- En la misma cromatoplaca, pulverizando el área de la zearalenona y ocratoxinas con la solución de cloruro de aluminio 2.3. (no calentar), se mejora la visualización de estas micotoxinas a la luz ultravioleta de 366 y 254 nm (1, 4, 6, 8, 31).

7.- CONFIRMACIONES

7.1.- AFLATOXINAS G2, G1, B2, B1.

7.1.1.- Desarrollar las cromatoplacas con los solventes nº 2 y 3, respectivamente, pero aplicando a las dos cromatoplacas la reacción con el ácido trifluoroacetico (32) y la posterior pulverización con el ácido sulfúrico (29).

Confirmación e identidad de las aflatoxinas G1 y B1 por transformación de estas aflatoxinas en B2a y G2a (32,33)

7.1.2.- En cada una de las cromatoplacas, seleccionar dos zonas ( A y B). Depositar en ambas zonas, los mismos volúmenes de extracto de muestra problema, al igual que los patrones interno y externo (tal como se indico anteriormente en la base del método).

7.1.3.- Cubrir la zona A con una lamina de vidrio y en cada mancha de la zona B, superponer 2 microlitros de solución fresca de ácido trifluoroacetico en cloroformo (1+1). Dejar reaccionar 5 minutos protegiendo las cromatoplacas de la luz.

7.1.4.- Secar las cromatoplacas con una suave corriente de aire caliente (no más de 35-40ºC) durante 10 minutos o con corriente de gas nitrógeno durante 15 minutos.

7.1.5.- Proceder al desarrollo de ambas cromatoplacas (éstas estarán a temperatura ambiente) con los solventes nº 2 y 3 (el solvente nº 8 da también muy buenos desarrollos), respectivamente.

7.1.6.- Observar a la luz ultravioleta de 366nm y comparar la zona A con la B:

En la zona A, las aflatoxinas aparecerán en la forma y Rf habituales.

En la zona B, las aflatoxinas B1 y G1 ahora transformadas en B2a y G2a, respectivamente, aparecerán como manchas azul brillante fluorescente, muy cerca de la línea imaginaria donde se han colocado originalmente las manchas.
El Rf de las aflatoxinas B2a y G2a, será aproximadamente de ¼ del Rf como aparecen las aflatoxinas B1 y G1 en la zona B.

7.1.7.- Pulverizar ambas cromatoplacas con la solución de ácido sulfurico+agua (1+3) y observar a la luz ultravioleta de 360 nm, veremos en ambas zonas:

Aflatoxinas G2, G1, B2, B1

= mancha amarillo brillante fluorescente.

7.1.8.- Otros solventes de desarrollo para las aflatoxinas: nº 3, 4, 5, 6, 12, 15, 16, 32.

7.2.- ZEARALENONA Y STERIGMATOCISTINA.

Cromatoplacas 4 y 5.- El orden de aparición de menor a mayor Rf es: zearalenona, sterigmatocistina.

7.2.1.- Desarrollar las cromatoplacas con los solventes Nº 7 y 9, respectivamente o bien nº 30 o 31, respectivamente.

7.2.2.- Observar a la luz ultravioleta de 366 y 254 nm (20,22,30):

Zearalenona y Sterigmatocistina

= manchas igual que en cromatoplaca 1.

7.2.3.- Pulverizar con la solución de cloruro de aluminio 2.3 y calentar la cromatoplaca a 105ºC durante 10 minutos (22), enfriar en la oscuridad y pulverizar nuevamente con la solución de cloruro de aluminio (no calentar) y observar a la luz ultravioleta de 366 y 254 nm:

Zearalenona	= mancha azul-violeta brillante fluorescente.
Sterigmatocistina	= mancha amarillo brillante fluorescente.

Con esta segunda pulverización se mejora la visualización de las micotoxinas con respecto al fondo de la cromatoplaca (1, 4, 8, 34).

7.2.4.- Otros solventes de desarrollo para zearalenona y sterigmatocistina: nº 3, 4, 5, 6, 12, 15, 16.

7.3.- ZEARALENONA.

Cromatoplacas 6 y 7.- Desarrollar con los solventes nº 3 y 49, respectivamente.

7.3.1.- Secar las cromatoplacas al aire durante 5-10 minutos solamente (no sobresecar).

7.3.2.- Observar rápidamente a la luz ultravioleta de 366 y 254 nm:

Zearalenona

= mancha igual que en cromatoplaca 1.

7.3.3.- Pulverizar uniformemente las cromatoplacas con solución de Fast Violet B salt 2.11.(35).

7.3.4.- Después, pulverizar con la solución pH 9,0 buffer 2.10.hasta que la cromatoplaca aparezca mojada (35).

7.3.5.- Secar con corriente de aire durante 5-10 minutos y observar a la luz visible:

Zearalenona

= mancha rosada.

7.3.6.- Después, pulverizar con solución de ácido sulfúrico al 50 % y calentar 5 minutos a 120ºC (35).

7.3.7.- Observar a la luz visible:

Zearalenona

= mancha color malva.

7.3.8.- Otros solventes de desarrollo para zearalenona y con estas condiciones de revelado: nº 4, 7, 9

7.4.- OCRATOXINAS.

Cromatoplacas 8 y 9.- El orden de aparición de menor a mayor Rf en cromatoplaca 8 es: ocratoxina B, ocratoxina etil éster B, ocratoxina A, ocratoxina etil éster A.
En la cromatoplaca 9 es: ocratoxina B, ocratoxina A, ocratoxina etil éster B y ocratoxina etil éster A.

7.4.1.- Desarrollar con los solventes nº 10 y 11, respectivamente.

7.4.2.- Observar a la luz ultravioleta de 366 y 254 nm (20,22,36):

Ocratoxinas

= manchas iguales que en cromatoplaca 1.

7.4.3.- Exponer la cromatoplaca 8 a los vapores de amoniaco (18,37).

7.4.4.- Pulverizar la cromatoplaca 9 con la solución de cloruro de aluminio 2.3. y calentar 10 minutos a 105ºC (22,37), enfriar en la oscuridad y pulverizar nuevamente con la solución de cloruro de aluminio (no calentar).

7.4.5.- Observar ambas cromatoplacas a la luz ultravioleta de 366 y 254 nm:

Ocratoxinas

= manchas azul brillante fluorescente

7.4.6.- Con esta segunda pulverización se mejora la visualización de estas micotoxinas con respecto al fondo de la cromatoplaca (1, 4, 6, 8).

7.4.7.- Con el solvente de desarrollo nº 10 el orden de aparición de la ocratoxina A y ocratoxina etil éster A esta intercambiado en comparación con los solventes de desarrollo normalmente usados. Con el solvente de desarrollo nº 34 se consigue el mismo efecto. Así pues los solventes nº 10 y 34 juntamente con los revelados, proporcionan un cierto método de confirmación de estas ocratoxinas (1, 4, 8).

7.5.- OCRATOXINA A Y OCRATOXINA ETIL ESTER A.

Cromatoplaca 10.- El orden de aparición de menor a mayor Rf es: ocratoxina A, ocratoxina etil éster A.

7.5.1.- Desarrollar con el solvente nº 12.

7.5.2.- Observar a la luz ultravioleta de 366 y 254 nm (20,22,36).

Ocratoxinas

= manchas iguales que en cromatoplaca 1.

7.5.3.- Pulverizar la cromatoplaca con una solución de bicarbonato de sodio 2.4., dejar secar 3-4 minutos a temperatura ambiente (36).

7.5.4.- Pulverizar nuevamente con la solución de bicarbonato de sodio 2.4.

7.5.5.- Observar a la luz ultravioleta de 366 y 254 nm:

Ocratoxina A y ocratoxina etil éster A

= mancha azul brillante fluorescente.

7.5.6.- Con esta segunda pulverización se consigue una mejora de la visualización de estas micotoxinas con respecto al fondo de la cromatoplaca (1, 4, 8).

7.5.7.- Otro solventes de desarrollo para ocratoxina A y ocratoxina etil éster A: nº 13, 14, 15, 16, 32, 33.

8.- OTRAS MICOTOXINAS

8.1.- CITRININA.

8.1.1.- Para el análisis de esta micotoxina, utilizar las cromatoplacas previamente impregnadas con ácido glicolico 1.31.

Cromatoplacas 11, 12 y 13.- Desarrollar con los solventes nº 35, 43 y 44, respectivamente.

8.1.2.- Observar a la luz ultravioleta de 366 y 254 nm (23):

Citrinina

= mancha amarillo brillante fluorescente que es menos intensa a 254 nm.

8.1.3.- Exponer las cromatoplacas 11 y 12, a los vapores de amoniaco durante 15-20 segundos (38):

Citrinina

= desaparece la fluorescencia amarillo brillante.

8.1.4.- Pulverizar la cromatoplaca 13 con la solución de cloruro de aluminio 2.3. y calentar 5 minutos a 105ªC (19,20,21), enfriar 1 minuto en la oscuridad.

8.1.5.- Observar a la luz ultravioleta de 366 y 254 nm:

Citrinina

= mancha azul-cielo fluorescente con similar intensidad a las dos longitudes de onda.

8.1.6.- Exponer la cromatoplaca 13 a los vapores de amoniaco durante 15-20 segundos y observar a la luz ultravioleta de 366 y 254 nm (1, 2,3).

Citrinina

= la fluorescencia azul-cielo de la citrinina no desaparece completamente, al menos en cantidades de 0,1-0,2 µg /mancha.

8.1.7.- Otros solventes de desarrollo para citrinina: nº 1, 7, 36, 37, 38, 39, 40, 45.

8.2.- DIACETOXISCIRPENOL Y TOXINA T-2.

Cromatoplacas 14, 15 y 16.- El orden de aparición de menor a mayor Rf es: diacetoxyscirpenol, toxina T-2.

8.2.1.- Desarrollar la cromatoplaca 14 con el solvente nº 20, y repetir si es necesario desarrollando las cromatoplacas 15 y 16 con los solventes nº 15 y 19, respectivamente. Cuando se utilice el solvente nº 19, la cromatoplaca debe ser activada previamente 1 hora a 110ºC.

8.2.2.- Pulverizar con la solución de ácido sulfurico+metanol (1+4), calentar 10 minutos a 120ºC (18), enfriar en la oscuridad y pulverizar abundante con agua destilada hasta que la cromatoplaca aparezca mojada (no calentar) (1, 4, 6, 8).

8.2.3.- Dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos y observar a la luz ultravioleta de 366 nm:

Toxina T-2	= mancha azul-cielo fluorescente.
Diacetoxiscirpenol	= mancha marron-azulado fluorescente

8.2.4.- Con esta segunda pulverización se mejora la visualización de estas micotoxinas con respecto al fondo de la cromatoplaca y a interferencias.

8.2.5.- Otros solventes de desarrollo para diacetoxyscirpenol y toxina T-2: nº 16, 32.

8.2.6.- Otros solventes de desarrollo para estas micotoxinas analizadas por separado: nº 3, 5, 6, 23, 25, 26.

8.2.7.- El solvente de desarrollo nº 3 es muy bueno para diacetoxyscirpenol analizado por separado.

8.2.8.- A veces, después de la pulverización con agua destilada hasta la cromatoplaca estar mojada, es mejor dejar reposar más tiempo a temperatura ambiente, 20 minutos en lugar de 10 minutos

8.3.- ACIDO PENICILICO.

Cromatoplacas 18, 19 y 20.- Desarrollar la cromatoplaca 18 con el solvente nº 21 y repetir si es necesario desarrollando las cromatoplacas 19 y 20 con los solventes nº 30 y 22, respectivamente.

8.3.1.- Pulverizar con la solución ácida de p-anisaldehido 2.6. y calentar 10 minutos a 130ºC (39).

8.3.2.- Enfriar en la oscuridad y pulverizar abundante con agua destilada hasta que la cromatoplaca aparezca mojada (no calentar) ((1, 4, 6, 8).

8.3.4.- Observar a la luz visible (1.29.) por reflexión y transparencia al mismo tiempo:
Acido penicilico = mancha verde esmeralda.

8.3.5.- Observar a la luz ultravioleta de 366 nm:
Acido penicilico = mancha azul.

8.3.6.- Otros solventes de desarrollo para ácido penicilico: nº 15, 16, 23, 24, 26, 27, 33. 8.3.7.-

Atención, después de la segunda pulverización con agua destilada, observar la cromatoplaca rápidamente ya que el color verde esmeralda desaparece lentamente.

8.4.- PATULINA.

Cromatoplacas 21, 22, 23.- Desarrollar la cromatoplaca 21 con el solvente nº 20 y repetir si es necesario desarrollando las cromatoplacas 22 y 23 con los solventes nº 25 y 3, respectivamente.

8.4.1.- Pulverizar con la solución de MBTH mencionada en 2.5. hasta que la cromatoplaca aparezca mojada y calentar 15 minutos a 130ºC (40), enfriar 1 minuto en la oscuridad.

8.4.2.- Observar a la luz visible (1.29.) por reflexión y transparencia al mismo tiempo:
Patulina = mancha amarilla.

8.4.3.- Observar a la luz ultravioleta de 366 nm (1, 4): Patulina = mancha amarilla anaranjada.

8.4.4.- Pulverizar la cromatoplaca con una solución de ácido fórmico 90%+agua (2+98) hasta que la cromatoplaca aparezca mojada (pulverización abundante), dejar a temperatura ambiente durante 30 minutos o más y observar a la luz ultravioleta de 366 nm (4,41).

La patulina aparece igual que anteriormente pero con una mejora de la visualización con respecto al fondo de la cromatoplaca.

8.4.5.- Otros solventes de desarrollo para patulina: nº 9, 5, 16, 26, 27, 28.

8.4.6.- También se obtienen muy buenos resultados en el desarrollo, si a los solventes nº 20, 25 y 3 se les añade 1 ml de ácido fórmico 90%, o bien si a los solventes anteriores nº 9, 5, 16, 26, 27 y 28, se les añade 0,5 ml de ácido fórmico (4,41).

8.5.- Penitrem A y Penitrem B.

Cromatoplacas 24, 25 y 26. - El orden de aparición de menor a mayor Rf es: Penitrem A, Penitrem B.

8.5.1.- Desarrollar la cromatoplaca 24 con el solvente nº 3 y repetir si es necesario desarrollando las cromatoplacas con los solventes nº 25 y 29, respectivamente.

8.5.2.- Pulverizar con la solución de cloruro férrico 2.7. y calentar suave 5-10 minutos con aire que procede de un secador de cabello (18).

8.5.3.- Pulverizar con agua destilada y observar a la luz visible (1.29.) por reflexión y transparencia al mismo tiempo (1,4,6) Penitrem A y Penitrem B = manchas verdes.

9.- ANALISIS DE AFLATOXINAS EN LA MANDIOCA, PATATAS SECAS Y SUBPRODUCTOS DE PATATA.

9.1.- Para el análisis de aflatoxinas en estas materias primas (en especial la mandioca) da buenos resultados efectuar un previo desarrollo de la cromatoplaca con éter etílico anhidro en cámara insaturada y hasta una altura de 12-13 cm (42,43).

Las aflatoxinas se desplazaran poco y en cambio la substancia interferente contenida en estas materias primas y que es la scopoletina, se desplazará significativamente.

La scopoletina aparece como mancha azul brillante fluorescente muy intensa y normalmente se localiza en la misma zona y Rf donde aparece la aflatoxina B1, pudiendo crear confusión.

Si bien es verdad que la scopoletina no aparece como mancha amarilla brillante fluorescente a 366 nm (después de la pulverización con la solución acuosa de ácido sulfúrico), la presencia de scopoletina en el área y Rf de la aflatoxina B1, imposibilita detectar la presencia de ésta.

9.2.- Secar la cromatoplaca y desarrollar en la misma dirección con los solventes adecuados para aflatoxinas, continuar después como anteriormente referimos para estas micotoxinas.

Nota: A veces, este sistema funciona bien en el análisis de aflatoxinas en productos que contienen clorofilas.



10.- ANALISIS QUANTITATIVO

Método del limite inferior de comprobación (1, 8, 44-46)

10.1.- En cada laboratorio y en sus condiciones de trabajo incluyendo el analista hay que fijar primero para cada micotoxina cual es lo que llamaremos limite inferior de comprobación.

Para ello serán elaboradas una serie de diluciones de la micotoxina o micotoxinas patrón y se determinará el limite inferior de comprobación en la cromatoplaca. O sea que en las condiciones de revelado adecuadas, se fijara para que dilución puede comprobarse todavía la micotoxina.

10.2.-A esa dilución corresponderán evidentemente un determinado numero de microgramos de micotoxina que podremos fácilmente calcular ya que sabemos la concentración de la solución de patrón.

10.3.- Del extracto solución A (muestra problema) se cromatografiaran también una serie de diluciones, determinándose para que dilución puede comprobarse todavía la micotoxina en aquellas condiciones de revelado adecuadas.

10.4.- Del limite inferior de comprobación y del factor de dilución se puede calcular la cantidad de micotoxina en cuestión.

10.5.- Relacionar el volumen de la mancha (muestra problema) para el que todavía puede comprobarse la micotoxina con el limite inferior de comprobación de la micotoxina en cuestión (ambos parámetros en las mismas condiciones de trabajo y revelados).

10.6.- Si es necesario efectuar interpolación entre dos volúmenes de mancha.

10.7.- En la Tabla 1, damos unos limites inferiores de comprobación (microgramos/mancha) para diferentes micotoxinas y con diferentes revelados. Veamos una secuencia de trabajo y de calculo:

10.8.- Efectuar a partir del extracto solución A, dos diluciones, a saber:

10.9.- Tomar 50 microlitros de extracto solución A y añadir 200 ml de cloroformo, mezclar bien, llamaremos extracto solución B.

10.10.- Tomar 50 microlitros de extracto solución A y añadir 1200 ml de cloroformo, mezclar bien, llamaremos extracto solución C.

10.11.- Depositar en la cromatoplaca 1, 2, 3, 4 y 5 microlitros de extracto solución A, llamaremos zona A.

10.12.- Depositar en la misma cromatoplaca 1, 2, 3, 4 y 5 microlitros de extracto solución B, llamaremos zona B.

10.13.- Depositar en la misma cromatoplaca 1, 2, 3, 4 y 5 microlitros de extracto solución C, llamaremos zona C.

10.14.- Depositar en un punto aparte, 3 microlitros de la solución patrón de la micotoxina que va a ser cuantificada (patrón externo).

10.15.- Proceder al desarrollo con el mismo solvente utilizado para el análisis cualitativo y en las mismas condiciones y revelados utilizados para el análisis cualitativo

10.16.- Observar y fijar cual es la última mancha de la micotoxina que aún es visible y en que zona ( A, B o C)

10.17.- Si la última mancha de la micotoxina que aún es visible está en la zona A, aplicar directamente la Formula 1, a saber:

microgramos de micotoxina / Kg de producto = L x V x 108 / a x 50 x P (Fórmula 1)

L = limite inferior de comprobación (en microgramos de la correspondiente micotoxina) (ver Tabla 1).
V = volumen del extracto solución A (en ml) (0,5 ml).
a = volumen correspondiente a la ultima mancha que aún se ve de la micotoxina (en microlitros)
P = peso de la muestra (en g)

10.18.- Si la última mancha de la micotoxina que aún es visible está en la zona B, aplicar la Formula 1 y multiplicar el resultado por 5.

10.19.- Si la ultima mancha de la micotoxina que aún es visible está en la zona C, aplicar la Formula 1 y multiplicar el resultado por 25

10.20.- Si la última mancha aún es visible en la zona C, preparar otra cromatoplaca y continuar a diluir con la misma secuencia de dilución y proceder con la misma secuencia de factor de calculo que se deduce de los pasos anteriores.

10.21.- Si no se quiere partir siempre del extracto solución A se puede hacer a partir de cada una de las diluciones anteriores, o sea:

50 microlitros de extracto solución A + 200 microlitros de cloroformo = extracto solución B.
50 microlitros de extracto solución B + 200 microlitros de cloroformo = extracto solución C.
50 microlitros de extracto solución C + 200 microlitros de cloroformo = extracto solución D.

............ y así sucesivamente.

11.- NOTAS.

11.1.- Tal como decimos en Tabla 1, cada analista debe buscar en sus condiciones de trabajo, cuales son estos limites inferiores de comprobación, diluyendo los patrones de micotoxinas adecuadamente, por eso la Tabla 1, da una buena orientación al respecto.

11.2.- El método ha sido aplicado durante muchos años con buenos resultados a: maíz, trigo, cebada, sorgo, arroz, centeno y subproductos de estos cereales, harina de soja, harina de cacahuete, harina de girasol, harina de coco, harina de palmiste, harina de colza, pulpa de remolacha, harina de linaza, cascara de almendra, mandioca, patatas secas y sus subproductos, piensos compuestos de aves, cerdos y rumiantes, hasta el momento no tiene sido aplicado a otros productos para alimentación animal.

11.3.- Las micotoxinas que han presentado siempre mayor dificultad de análisis, son: la toxina T-2, diacetoxyscirpenol y el ácido penicilico, sin embargo los resultados en general han sido razonables.

11.4.- La Tabla 1 ayuda al analista para que prepare sus soluciones patrón de cara a determinar en sus condiciones de trabajo cual es el limite inferior de comprobación.

11.5.- En los análisis de micotoxinas, debe ser evitada la luz natural y luz solar directa, es aconsejable trabajar con luz de fluorescente.

11.6.- Proteger de la luz las soluciones de micotoxina (conservar en la oscuridad y utilizar hojas de papel de aluminio).

TABLA 1.- Limites inferiores de comprobación (microgramos/mancha) en la cromatoplaca para varias micotoxinas.