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1Higiene de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. Aptdo. de Correos 643. 10071-Cáceres. 2Viticulture and Enology. University of California, Davis. E-mail: marrodri@unex.es.
Las bacterias ácido lácticas y las bacterias acéticas pueden formar parte de la microbiota natural de los procesos de fabricación del vino. Estas bacterias transforman una gran variedad de compuestos orgánicos presentes en el mosto y en el vino originando productos que afectan a las características organolépticas finales del vino. El desarrollo de estos microorganismos, por tanto, puede tener efectos beneficiosos (fermentación maloláctica) o perjudiciales (picado láctico y acético, enturbiamiento, olores anómalos, etc.) dependiendo de las especies y de la etapa de la vinificación en que se desarrollen. Por tanto es fundamental disponer de métodos rápidos que permitan identificar las bacterias lácticas y acéticas presentes durante la producción del vino para mantener el control de la calidad microbiológica.
El T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism) es un método que combina las técnicas de PCR y RFLP para identificar de forma fiable y rápida las diferentes especies de microorganismos presentes en una comunidad bacteriana. En este trabajo se ha optimizado una técnica de T-RFLP para detectar las principales bacterias que pueden encontrarse a lo largo de la fermentación del vino.
Se utilizaron 25 cepas de las especies más frecuentemente encontradas en vinos, pertenecientes a los géneros Lactocobacillus, Oenococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Acetobacter, Gluconobacter y Gluconoacetobacter. Se desarrolló una PCR utilizando los cebadores 6-FAM-63F (marcado en el extremo 5’ con 6-carboxyfluoresceína) y WBAC2. Estos fragmentos amplificados fueron digeridos por separado con los enzimas de restricción, Hae III, Bsr I, Sau 96I y Hinf I. El primer fragmento de restricción marcado con fluoresceína de cada digestión fue visualizado y analizado con un secuenciador Abi Prism 3100 determinando el tamaño del fragmento con el programa GeneScan analysis v 3.5.2. El análisis del tamaño en pares de bases de los fragmentos de restricción marcados, permitió establecer un patrón para cada una de las especies ensayadas, lo cual fue utilizado para identificar todas las especies de forma fiable.
Se comprobó la sensibilidad de la reacción de PCR diseñada en mezclas de distintas concentraciones de microorganismos con la levadura Saccharomyces cerevisiae, pudiendo detectar algunas de estas bacterias a niveles entre 100 y 10 ufc/ml.
En conclusión, estos resultados demuestran la fiabilidad y sensibilidad del método puesto a punto, puesto que permite la identificación a nivel de especie de la mayor parte de las bacterias presentes en el vino.
Este trabajo ha sido realizado gracias a la ayuda concedida por el Ministerio de Educación, Cultura y Deporte para estancias de profesores de universidad en centros extranjeros.