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Departamento de Biotecnología, Universidad Politécnica de Valencia. 46022 VALENCIA, ESPAÑA. rmontes@btc.upv.es
Las micotoxinas son producidas por un grupo de hongos, entre ellos Fusarium ssp. que pueden causar una variedad de síntomas hepatotoxicologícos, nefrotoxicologías o efectos carcinogénicos. Se debe tener en cuenta que los métodos tradicionales de aislamiento e identificación de Fusarium sp. son tediosos, caros y consumen mucho tiempo. Además, para comprobar si son productores de micotoxinas, se deben incubar en sustratos y condiciones adecuadas y para su detección se hacen necesarios métodos cromatográficos. La identificación basada en PCR es una alternativa eficaz que puede ser usada en la detección de genes implicados en la producción micotoxinas así como en la identificación de género y especie.
El objetivo de este trabajo es la identificación por PCR de especies del género Fusarium aisladas de grano de maíz y la detección de especies productoras de tricotecenos y especialmente deoxynivalenol (DON). En este estudio se utilizaron como cepas de referencia: Fusarium culmorum, F. oxysporum fsp. lycopersici, F. poae, F. roseum, F. solani, F. sporotrichioides, F. tricinctum, F. verticillioides, Gibberella intricans, G. zeae. Todas estas especiesfueron suministradas por CECT.
La extracción de DNA fue realizada moliendo el micelio con nitrógeno líquido y siguiendo el procedimiento del CTAB. Los iniciadores FF2 y FR1 son usados para amplificar 425-bp del gen18S rRNA, fragmento que esta relacionado en la producción de tricotecenos son específicos para el género Fusarium. Las condiciones de amplificación de la PCR son: un ciclo en 94 º C durante 4 minutos, seguido de 35 ciclos de 94 º C durante 1 minuto, 58 º C para 30 s, y 72 º C durante 45 segundos, y finalmente, un ciclo de elongaciónen72 º C de 5 minutos.
Para el iniciador Tox5-1 y Tox5-2 usado para amplificar un fragmento de 658-bp, el cual es relacionado con la producción DON. Las condiciones para PCR son: un ciclo de 94 º C durante 2 minutos seguido de 35 ciclos de 95 º C durante 1 minuto, 63 º C para 50 s, y la extensión en 72 º C para 30 s, y finalmente, un ciclo de elongación de 72 °C por 5 minutos.
Los iniciadores FF2 y FR1 mostraron buena especificidad para cepas de Fusarium y amplificó el fragmento 425-bp en las cepas de referencia productoras de tricotecenos. Estos iniciadores amplificaron el mismo fragmento en 63 cepas de Fusarium de 174 aisladas en este trabajo. Los iniciadores Tox5-1 y Tox5-2 amplificaron el fragmento 658-bp en las cepas de referencia que están catalogadas como productoras de DON, como también en 19 de aislados de los 174.
El uso de la PCR permite una rápida y específica identificación de cepas de Fusarium. Con esta técnica se pueden detectar, además, genes que codifican la producción de tricotecenos y DON.