Optimización de una técnica de PCR para la detección rápida (6 h de enriquecimiento) de ECVT en productos lácteos de ovino sometidos a refrigeración.

^aCaro, I.; ^bMateo, J. ; ^cRúa, J. y ^bGarcía-Armesto, M.R.

^aUniversidad Autónoma del Estado de Hidalgo, Méjico; ^bDpto. Higiene y Tecnología de los Alimentos y ^cDpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de León. 24007 León. España. E-mail: dhtmga@unileon.es

Hasta el momento actual, no existe un consenso sobre la metodología más efectiva para la detección rápida de Escherichia coli verotoxigénicos (ECVT) a partir de alimentos. Con el presente trabajo se pretente investigar el efecto de diferentes tiempos de incubación (0, 6 y 22 h) y medios de cultivo (mTSB+novobiocina y TSB+extracto de levadura) sobre la eficacia de una técnica de PCR múltiple para la detección de ECVT, así como el efecto que sobre la sensibilidad de la técnica de PCR rápida (6 h de enriquecimiento a 42ºC) pudiera tener la refrigeración de la leche inmediatamente después de su obtención.

El límite de detección de la PCR múltiple desarrollada en leche de oveja para detectar los genes stx₁ y stx₂ que codifican la producción de verotoxinas en los dos caldos de enriquecimiento antes mencionados (Caro et al., 2002), se incrementó en 3-4 log₁₀ después de una etapa de enriquecimiento de 6 h de incubación a 42ºC con respecto a los resultados obtenidos a tiempo 0 h (ausencia de incubación). Por lo que se refiere al efecto de la composición del medio de enriquecimiento sobre el límite de detección de ECVT, la técnica de PCR múltiple mostró una sensibilidad ligeramente superior (de aproximadamente media unidad logarítmica) cuando se utilizó TSB+extracto de levadura, que cuando se empleó mTSB+novobiocina. En relación con el efecto de la refrigeración de la leche de oveja a 4ºC durante 72 h previamente a la detección de ECVT, no se apreció efecto alguno sobre la sensibilidad de la técnica rápida de PCR cuando el enriquecimiento (6 h de incubación a 42ºC) se hizo en caldo no selectivo (TSB+extracto de levadura).

La técnica de PCR múltiple después de 6 h de enriquecimiento a 42ºC fue lo suficientemente sensible para detectar niveles de ECVT ≥ 0,02 ufc/ml de leche de oveja. Estos niveles coinciden con los más bajos encontrados en muestras de leche de oveja naturalmente contaminadas (Caro, 2004). Por otra parte, la presencia de agentes selectivos y, en particular, la presencia de sales biliares puede haber influido en la menor sensibilidad de la técnica de PCR partiendo de mTSB+novobiocina. Finalmente, los resultados obtenidos al reproducir en el laboratorio las condiciones de almacenamiento a refrigeración a que se somete habitualmente la leche de oveja en la explotación, indicaron que dichas condiciones parecen no afectar a la viabilidad de los ECVT estudiados (origen lácteo ovino) y, por tanto, al límite de detección de la técnica rápida de PCR (enriquecimiento a 42ºC durante 6 h).

Caro, I.; Santos, J.A.; Alonso, A. Rúa, J. y García-Armesto, M.R. (2002). XXV Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular. Libro de Comunicaciones, p.: 262.

Caro, I. (2004). Tesis Doctoral. Universidad de León.