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Nutrición y Bromatología, Escuela de Ingenierías Agrarias, Universidad de Extremadura, Carretera de Cáceres s/n, 06071 Badajoz. ¹Higiene de los alimentos, Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura, Avda. Universidad s/n, 10071-Cáceres. ²Food Sciences, University of Nottingham, Sutton Bonnington, Loughborough, LE12 5RD, Reino Unido.
P. chrysogenum Pg222 aislado de jamón curado muestra una intensa actividad proteolítica sobre proteínas cárnicas que se traduce en una mayor generación de compuestos volátiles en los productos donde se inocula. Sin embargo, en muchas ocasiones el crecimiento fúngico sobre el producto no es deseado. Una alternativa es la utilización durante la maduración de enzimas responsables de la actividad hidrolítica del microorganismo. Se ha obtenido una nueva proteasa (EPg222) de P. chrysogenum Pg222 (Benito y col., 2002) que muestra elevada actividad proteolítica en carne y productos cárnicos. El objetivo del presente trabajo ha sido determinar los genes que codifican el enzima para su expresión y obtención en sistemas que permitan la producción a gran escala.
EPg222 purificada según Benito y col. (2002) fue analizada en gel de poliacrilamida con tinción coloidal, para su posterior caracterización mediante espectrometría de masas con Micromass ES Q-TOF. Así se obtuvo la secuencia de diferentes péptidos con los que se diseñaron cebadores para la amplificación del gen mediante PCR. Los productos de la PCR obtenidos fueron purificados de los geles de agarosa y clonados para su secuenciación. Para determinar el número de copias del gen en el ADN genómico de P. chrysogenum se realizó digestión con los enzimas Eco RI, Bam HI y Sma I y se hizo un Southern blotting con la sonda diseñada a partir de la secuencia del gen encontrada.
La secuencia aminoacídica obtenida para la proteasa correspondió a AMNDAAANVVK, LLFNGLNAK, SVMNMSLGGAFSR, ENVVQPNAPSWGL y AWAVKDAK. La PCR realizada con los cebadores diseñados a partir de los péptidos ENVVQPNAPSWGL y AWAVKDAK generó un fragmento de 360 pb que presenta alta homología con las serin proteasas de P. chrysogenum. Se diseñaron nuevos cebadores a partir de esta secuencia, de la región homologa del péptido señal y de la secuencia correspondiente al final de la proteína obtenida mediante espectrometría de masas. A partir de los productos de la PCR fue obtenida la secuencia completa, que ha sido publicada en GenBank database con el número de acceso AJ870492 y CAI38757.1 para la secuencia aminoacídica. El resultado de Southern Blotting reveló que solo hay una copia de la proteasa en el genoma de Penicillium chrysogenum. La secuencia encontrada se ha expresado en E. coli y Pichia pastoris comprobándose la producción de la proteasa, lo cual será de gran utilidad para la expresión y producción a gran escala del enzima EPg222 para su uso en carne y productos cárnicos.
Benito, M.J.; Rodríguez, M.; Nuñez, F.; Asensio, M.A.; Bermúdez, M.E y Córdoba, J.J. (2002). Appl. Environ. Microbiol. 68, 3532-3536.
Este trabajo ha sido subvencionado con financiación procedente de los proyectos del Ministerio de Ciencia y Tecnología ALI98-0253 y AGL01-0804 y de la Junta de Extremadura 2PR04C022.