Estudio de cepas de campo de Haemophilus parasuis mediante mutilocus sequence typing.

Olvera A. y Aragón V.

Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), 08193-Cerdanyola del Vallès (Barcelona) SPAIN. alexandre.olvera@cresa.uab.es

Haemophilus parasuis es el agente etiológico de la enfermedad de Glässer y otras patologías porcinas. Por otro lado, también puede aislarse del tracto respiratorio superior de animales sanos y por lo tanto, diferentes aislados de H. parasuis pueden presentar distinta virulencia. Hasta el momento, las diferentes cepas han sido principalmente clasificadas utilizando serotipado, pero esta técnica no resulta suficientemente discriminatoria para estudios epidemiológicos; además de haber una cantidad significativa de aislados no serotipables. Una técnica alternativa para diferenciar cepas de campo es la enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR (ERIC-PCR). Esta técnica permite diferenciar aislados a nivel genotípico, pero los resultados obtenidos son difíciles de comparar entre distintos laboratorios. Con el objetivo de conseguir un método de diferenciación de cepas que no presentara ambigüedades, desarrollamos un sistema de multilocus sequence typing (MLST). La selección de genes conservados para su uso en el MLST estuvo restringida por el poco conocimiento que se tiene del genoma de H. parasuis. En la bibliografía se hallaron cebadores universales para los genes de la cadena b ATP sintasa (atpD), subunidad b de la RNA polimerasa (rpoB) y elfactor de inicio de la traducción IF-2 (infB). El locus malato deshidrogenasa (mdh) se amplificó usando los cebadores del MLST de H. influenzae sin modificar. Finalmente, los genes 6-phosphogluconato deshidrogenasa (6pgd), fumarato reductasa (frd), y glyceraldehido-3-fosfato deshidrogenase (g3pd), se amplificaron utilizando cebadores diseñados por homología con los genes correspondientes de otras Pasteurellaceae. Previamente, se había demostrado que los enzimas Mdh, 6Pgd y Frd de H. parasuis presentaban diferentes movilidades electroforéticas utilizando el método conocido como multilocus enzyme electrophoresis (MLEE). Fragmentos de entre 500 y 600 pares de bases fueron amplificados, secuenciados y alineados para ser analizados. Las condiciones de amplificación y secuenciación se optimizaron con once cepas de referencia y posteriormente se añadieron al estudio cepas de campo. El número de alelos por locus presentaba una amplia variabilidad entre genes. A través de los perfiles alélicos resultantes, las cepas analizadas se asignaron a diferentes tipos secuenciales (sequence type), que en algunos casos resultaron ser únicos, y se procedió a realizar un análisis de tipo eBurst. Los resultados obtenidos animan a ampliar el estudio a más cepas de campo y a validarlo para su uso en estudios epidemiológicos y la identificación de posibles clones de H. parasuis.