GTG₅-PCR, una herramienta para la diferenciación de especies próximas en el género Vibrio.

Pascual, J.^1,2, Cuesta, G.^2,3, Macián, M.C.^1,2, Garay, E.^1,2,4 y Pujalte, M.J.^1,2

¹Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Biología Evolutiva (ICBiBE), ²Departamento de Microbiología y Ecología, y ⁴Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Universitat de València. Campus de Burjassot, 46100 València. ³Departamento de Biotecnología-Microbiología. Universidad Politécnica de Valencia. España. pasmar@alumni.uv.es

La técnica de REP-PCR utilizando el oligonucleótido GTG₅ como cebador ha sido propuesta como equivalente a los AFLP y la hibridación DNA-DNA para la resolución del grupo de especies Vibrio harveyi-V.campbellii-V. rotiferianus, que presentan una gran proximidad en fenotipo y genotipo (Gómez-Gil et al. 2004).

Con el fin de optimizar la identificación de cepas de Vibrio harveyi virulentas para lubina, esta técnica se ha puesto a punto y se ha aplicado a 88 aislados de diferentes especies de peces cultivados (doradas, lubinas y dentones), las cepas tipo de V. harveyi y V. campbelli, y 7 cepas de referencia de V. campbellii cedidas por el Dr. Gómez-Gil (Collection of Aquacultural Important Microorganisms, CAIM, México). Los resultados obtenidos (con perfiles de 11 a 15 bandas por cepa, por término medio) fueron analizados (Pearson-UPGMA) mediante el programa GelCompar v4.1. El análisis permitió resolver un grupo principal, compuesto por la mayoría de los aislados, que se agruparon con la cepa tipo de Vibrio harveyi NCIMB 1280^T, confirmando así la correcta identificación previa realizada sobre el fenotipo. En un segundo grupo aparecieron reunidas todas las cepas de referencia de V. campbellii (CAIM) y la cepa tipo de dicha especie, NCIMB 1894^T. El tercer grupo reunió 13 cepas de lubina, más cercanas a V. campbellii que a V. harveyi, pero con un bajo nivel de semejanza. Un cuarto grupo de 6 cepas, aisladas de dorada, fue marginal.

La técnica se ha aplicado a otro grupo de cepas, similares a V. ichthyoenteri y V. scophthalmi, que no han podido ser asignadas a ninguna de las dos especies citadas. Son 24 aislados de dorada, que ocupan una situación intermedia entre ambas especies de acuerdo con los datos de secuenciación (gen 16S rDNA) e hibridación DNA-DNA, así como las cepas tipo de V. ichthyioenteri CECT 5675^T y V. scophthalmi CECT 4638^T, más 5 cepas de referencia de esta última especie. Tras el análisis de agrupamiento, todos nuestros aislados, menos uno, se agruparon formando un grupo compacto con la cepa tipo de V. scophthalmi y las restantes cepas de referencia de esta especie, mientras que la cepa tipo de V. ichthyoenteri y uno de los aislados quedaban claramente distantes.

Actualmente la técnica se está aplicando a Vibrio ponticus (Macián et al. 2005) para confirmar la adscripción de 19 cepas aisladas de dorada a dicha especie.

Los resultados conjuntos preliminares apuntan a la enorme utilidad de la técnica de rep-PCR con GTG₅ para identificar especies en el género Vibrio.

Bibliografía:

Gómez-Gil et al. (2004). Microbiology 150, 1769-1777.

Macián et al. (2005). Syst. Appl. Microbiol. 27, 535-540.